2019 Fiscal Year Research-status Report

トキソプラズマ潜伏により誘導される抗ウイルス応答：原虫とウイルスの攻防を紐解く

Research Project

Project/Area Number	19K22354
Research Institution	Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
Principal Investigator	玄学南帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (10292096)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	正谷達謄鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (70614072)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2022-03-31
Keywords	トキソプラズマ / タキゾイト / ブラディゾイト / ステージ変換 / 抗ウイルス / 自然免疫
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、培養細胞や実験動物を用いた原虫-ウイルス共感染実験によって、トキソプラズマ潜伏感染がウイルスの増殖や病原性に及ぼす影響を明らかにする。当該年度に得られた成果は下記の通りである。１）自然免疫に関与する宿主転写因子に注目して研究を行った。間接蛍光抗体法によりトキソプラズマ潜伏感染ヒト線維芽細胞におけるSTAT1の局在ならびにリン酸化を評価した結果、高pHによるブラディゾイトへの誘導を行った感染細胞ではSTAT1の核内移行が認められた。一方、通常のpHのまま培養することでタキゾイトのままにした場合、感染細胞ではSTAT1の核内移行が認められなかった。したがって、トキソプラズマのブラディゾイトステージ虫体は感染細胞のSTAT1を活性化することで抗ウイルス自然免疫応答を活性化させている可能性が考えられた。２）次に、トキソプラズマ潜伏感染が誘導する抗ウイルス自然免疫応答にSTAT1が担う役割を調べる目的で、CRISPR/Cas9に基づくゲノム編集によりSTAT1欠損細胞の作出を試みた。Cas9蛋白質およびガイドRNAを同時に発現できるpX330ベクターに、ピューロマイシン耐性遺伝子及びヒトSTAT1をターゲットとしたガイドRNA配列を組み込み、ヒト由来293T細胞に導入した。ピューロマイシンによるセレクションののち、クローニングし、ウェスタンブロットによってSTAT1が欠損していることを確認した。この細胞にトキソプラズマを潜伏感染させようと試みたが、高pHの条件では細胞が死滅してしまった。そのため現在、構築したプラスミドをヒト線維芽細胞に導入し、欠損細胞を作製している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の計画通りに進展し、所期の成果が得られたため。
Strategy for Future Research Activity	今後、STAT1欠損株における虫体ステージ変換の条件検討を詳細に行う。
Causes of Carryover	当初予定していた研究打合せのための旅費が未使用のため。