2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K22375
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
千葉 由佳子 北海道大学, 理学研究院, 准教授 (70509546)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 上流ORF / 概日時計 / シロイヌナズナ / 翻訳制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの生物は概日時計を持ち，概ね24時間の周期で様々な生命現象を制御している。植物では開花，気孔の開閉，茎葉の伸長，光合成の活性化などの重要な制御に関わる。シロイヌナズナの概日時計は，転写因子群からなる中心振動体とそれに付随する多数の複雑なフィードバックループ制御から成る。ここ数年の研究の進歩により，時計遺伝子のロバストな発現には様々な段階の転写後調節が重要であることが明らかとなってきているが，その全貌は未だ明らかとなっていない。本研究ではシロイヌナズナの時計遺伝子LHYに見つかった，上流ORF (uORF) におけるリボソーム停滞を介した時間依存的な翻訳制御に関して，その分子メカニズムと生理学的意義を明らかにすることを目指している。LHY mRNAの5’-UTRには5つのuORFが存在する。複数のuORFをもつ場合，相乗的にmain ORFの翻訳を制御する例が多い。本年度は，制御に重要なuORFを同定するために，5’末端から各uORFごとに欠失させたLHY 5’-UTRにレポーター遺伝子をつなげたコンストラクトおよび各uORFの開始コドンに変異をいれたLHY 5’-UTRにレポーター遺伝子をつなげたコンストラクトを作成し，それぞれを恒常的プロモーターにつなげた。タバコ葉を用いた一過的発現系を用いて発現解析をおこなったところ，uORFによる発現抑制は確認できたが，時間依存性は見られなかった。タバコ葉を用いていることが要因の一つと考えられるため，シロイヌナズナのプロトプラストを用いた一過的発現系の利用も試みた。一方で，これらのコンストラクトをもつシロイヌナズナの形質転換体の構築を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では制御に重要なuORFの同定が必須であり，当初は欠失コンストラクトによりある程度重要なuORFを絞り込むことができ，そのuORFに関してのみ変異コンストラクトを作成することを想定していた。しかしながら，実際には複数のuORFが協調して機能していることを示唆するデータが得られたため，ほぼすべてのuORFに関して変異コンストラクトを作成することとなり，思いのほか遺伝子クローニングと形質転換体の作成に時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は作成した形質転換体を用いて，レポーターアッセイ，LHY mRNAや LHYタンパクの発現を経時的に解析することで，翻訳制御に重要な役割を持つuORFを同定する。その結果にもとづいて，「ケミカルスクリーニングによるエフェクターの同定」および「LHY uORFによる時間依存的な翻訳制御の生理学的意義の解明」に関わる研究を展開する。
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| Causes of Carryover |
現在までの進捗状況に示したように，当初は欠失コンストラクトによりある程度重要なuORFを絞り込むことができ，そのuORFに関してのみ変異コンストラクトを作成することを想定していた。しかしながら，実際には複数のuORFが協調して機能していることを示唆するデータが得られたため，ほぼすべてのuORFに関して変異コンストラクトを作成することとなった。そのため，思いのほか遺伝子クローニングと形質転換体の作成に時間を要したため，シロイヌナズナのプロトプラストを用いた一過的発現系の構築とそれを用いた解析に遅れが生じ，研究費の繰越を必要とする事態となった。今後は一過的発現系の解析と，形質転換体を用いた解析を並行して進める。
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