2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of the artificial cell membrane via bottom-up of the channel-membrane reconstitution system
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19K22382
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
老木 成稔 福井大学, 高エネルギー医学研究センター, 特命教授 (10185176)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩本 真幸 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40452122)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 脂質2重膜 / イオンチャネル / 膜物性 / 膜張力 / 接触バブル2重膜法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脂質2重膜は膜蛋白質であるチャネルに居場所を与える単なる受動的な場ではなく、リン脂質などの化学組成や膜張力などの物理特性を通して能動的にチャネルに働きかけている。脂質2重膜の内部では膜張力・曲率・膜内電場などの物理特性が変化し、チャネルはその影響を大きく受け機能を変化させている。そしてそれらの物理特性は、脂質組成の変動や膜に溶け込む小分子（リガンドや薬物）によっても変化する。すなわち脂質2重膜は、リガンドや薬物が膜に入り込み化学組成変化が起これば、内部の物理特性を変化させ（化学－物理変換）、それをチャネルに作用させる、一種の「化学－物理変換体」である。この機構を解明することが本研究の目的であるが、生体膜の構造はあまりに複雑で詳細に解析することが難しい。そこでこれらの機構を解明するために生体膜を解体し、脂質2重膜にチャネルを組み込んだ系（再構成チャネル膜）で実験を行うことが本研究の戦略である。研究代表者らが世界に先駆けて開発した再構成チャネル膜法によって様々な実験が可能になってきた。この方法を展開することでチャネル－膜を再構成し、膜の化学組成や物理特性を変化させる操作を可能にし、その変化を詳細にとらえることが本研究の目的である。それによって、「脂質2重膜の化学-物理変換という普遍的な機構とチャネルへの作用」を解明する。特に膜張力は様々な生理的環境の中で変化し、その変化が直接チャネルに作用するので、膜張力をダイナミックに測定することが不可欠である。これにより従来、静的・半定量的であった実験の制度を上げ、より詳細なチャネル－膜相互作用について検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
私達が開発した接触バブル2重膜法がさらに安定して実験できるようになり、実験の効率が上がった。この方法により、実験中に膜を安定化させるための細かい操作がほぼ不要になり、実験に集中できるようになった。また膜張力を測定するための画期的な方法の開発に成功した。従来、膜張力を測定するには数ステップの実験とオフラインでの画像処理が不可欠であった。したがって張力に対するチャネルの応答も数秒オーダーの変化しかとらえることができなかった。新しい方法では膜張力の測定原理を見直し、バブル内圧の測定を行い、この値とバブル半径から張力を計算できるようにした。バブル圧はわずか100 Pa（< 1 mmHg）程度であり、従来このように低い圧を測定されたことはなかったが、高精度の圧測定器と様々な工夫により可能となった。これにより膜張力の変化を毎秒測定すると同時に単一チャネル電流との対応をつけることができるようになった。
この方法をKcsAカリウムチャネルの張力感受性（Iwamoto & Oiki, PNAS, 2018）を明らかにするために適用した。そして予想もしていなかったチャネルの膜張力に対するダイナミックな応答を捉えることができた。KcsAカリウムチャネルは膜張力増大時と減少時に異なる応答性をとる（ヒステレシス）ことを初めて明らかにした。膜張力に対する応答性にヒステレシスが発見されたのはこれが初めてである（。その理由の一つが従来の半定量的な測定を改善し、極めて精度が高く、応答性の速い実験系を確立したことにある。
一方、膜の化学組成に対するKcsAチャネルの応答も新しい結果を得ることができた。接触バブル２重膜法ではリーフレット毎にリン脂質組成を変えることができるのでこれを利用し、あるリン脂質の効果が明快なリーフレット依存性があることを初めて実験で証明することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
接触バブル2重膜法をさらに改良するアイデアが得られ、この方法を確立することが本年度の予定である。この方法により実験手技が格段に簡単になるだけでなく、膜張力測定の精度が上がり、より安定した長時間記録が可能になる。ソフトウェアの開発などを進めてより精度の高いシステムを確立する。
KcsAチャネル以外のものも実験系を確立しつつあり、膜組成の異なる条件などで実験を進めたい。
膜特性の他の物理特性も明らかにする、この特性変化によるチャネル活性の変化を捉えることに着手している。このチャネルに関してはすでに実験と対応させる計算機シミュレーションも進行中であり、実験結果をシミュレーション結果を対応させた詳細な解析につなげることができる。
接触バブル2重膜法と作成原理は同じだが、チャネル電流ではなく、水輸送を測定する実験系を開発中である。この系にアクアポリンを再構成して水透過性を測定するためのシステムを確立することを目指す。
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| Causes of Carryover |
一般の消耗品およびストップトフロー実験に要する消耗品の額が予定より少なかった。
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