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2019 Fiscal Year Research-status Report

multiple identification of non-ATP-dependent kinases based on registered crystal structures of enzymes with unknown function

Research Project

Project/Area Number 19K22385
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

藤橋 雅宏  京都大学, 理学研究科, 助教 (10397581)

Project Period (FY) 2019-06-28 – 2021-03-31
Keywords結晶構造 / リン酸化 / ピロリン酸
Outline of Annual Research Achievements

本研究では「生体内リン酸化反応のリン酸基供与体はATP、という常識は取り払うべきではないか?」という命題に挑む。従来生体内におけるリン酸化反応では、ごく一部の例外を除いてATPがリン酸基の供給源であると広く信じられてきた。これに対し我々は、ピロリン酸 (PPi) をはじめとする様々な高エネルギーリン酸結合を持つ化合物が、多くの場面でATPの代替をしていると考えている。そこで、立体構造並びに一次配列のデータベースに登録された情報を基に、PPi依存性のリン酸化酵素 (PPi-kinase) を大量同定することにより、生体内リン酸化反応におけるリン酸源はATPという従来の考えの転換を図る。
研究初年度には、立体構造データベースに登録されている機能未知酵素の立体構造に着目し、PPi依存性酵素の候補を探索した。過去に我々が発表した方法(文献1)を参考に、機能未知酵素とそれに類似したATP依存性の既知酵素の結晶構造を重ね合わせた。機能未知酵素上で、既知酵素のATP結合部位に対応する部位が、アミノ酸残基で埋められているものをPPi-kinaseの候補とした。このような検索の結果、複数のPPi依存性酵素の候補を決定することができた。またATPを結合した酵素の中には、ATPのアデニン環を特異的に認識する残基を持たないものも多かった。このような酵素はATP以外のヌクレオチド三リン酸によっても、リン酸化反応を触媒できる可能性が高い。
これらの候補酵素の一部については、結晶構造決定のために行われた実験を参考にしながら、発現系の構築も行った。
文献
1. Nagata, R., Fujihashi, M. et al. Nat. Commun., (2018), 9, 1765

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

おおむね計画通り、非ATP依存性酵素の候補を複数発見できた。

Strategy for Future Research Activity

非ATP依存性酵素の候補について、実際に活性を確認する。非ATP依存性と判明した酵素については結晶構造解析を行い、リン酸基供与体との複合体構造を決定する。これを基に、ATP依存性酵素の非ATP依存性酵素への改変や、一次配列データベースからの非ATP依存性酵素の発掘も行う。

Causes of Carryover

研究初年度(2019年度)は、データベース探索を主に行ったため、次年度使用額が生じた。この次年度使用額は、2020年度請求額と合算し、酵素を実際に作成し、活性確認の実験を行うために用いる。多数の実験を行うため、2020年度は2019年度と比べて必要額が極めて大きくなる見込みである。

  • Research Products

    (2 results)

All 2020 2019

All Presentation (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 1 results)

  • [Presentation] Finding and modifying pyrophosphate-dependent kinases based on crystal structures2020

    • Author(s)
      Masahiro Fujihashi
    • Organizer
      KAIST‐Kyoto‐NTHU Junior Chemist Symposium
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 結晶構造を基にした無機ピロリン酸依存性リン酸化酵素の探索2019

    • Author(s)
      藤橋雅宏
    • Organizer
      酵素・補酵素研究会2019

URL: 

Published: 2021-01-27  

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