2019 Fiscal Year Research-status Report
新しい膜蛋白質含有ナノ粒子の構築と蛋白質膜組過程の精密探査
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19K22395
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
塚崎 智也 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (80436716)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| Keywords | タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の動態をより詳細に解析するためには，これらの静止状態の構造だけでなく１ユニット(反応最小単位)での動的な解析が欠かせない。膜タンパク質は細胞膜に存在し，シグナル伝達，エネルギー変換，イオンやタンパク質の輸送といった細胞内の重要な機能を担っている。膜タンパク質の機能や構造は，脂質二重膜中に存在することで維持され，膜タンパク質が構造変化することでこれらの機能を発揮する。膜タンパク質の機能を明らかにするためには，脂質二重膜中で膜タンパク質の構造変化を観察する必要がある。従来法（例:細胞膜の状態；リポソーム再構成；平面膜再構成 など）では，膜の占める領域が広く，膜の流動性なども問題となり，詳細な解析の妨げとなっている。そこで，我々はナノディスクと呼ばれるリン脂質が膜骨格タンパク質に囲まれたディスク状の脂質二重膜と高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を用いて，膜タンパク質の構造変化を観察する系を構築した。高速AFMは高い時間分解能と空間分解能を持ち，タンパク質を支持基板に固定することでそのダイナミクスをリアルタイムで観察することができる。一方で，ナノディスクは膜タンパク質を細胞膜に近い環境で保持でき，膜タンパク質1分子を溶液中で扱うことを可能にする。典型的な膜タンパク質としてSecYEGなどをナノディスクに再構成し，支持基板に固定して高速AFM観察したところ，ナノディスクと膜タンパク質の可溶性ドメインの構造を確認できた。条件をととのえ，いくつかの反応中間体の動態観察に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質輸送過程の解明にむけて適切なナノディスクを選定し，準備を進めることができた。今後は，精密探査へと研究を展開することができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では高速AFMによりタンパク質含有ナノディスクを観察する条件を最適化してきた。最適化した条件にて，SecYEG再構成ナノディスクを用いて縦向きまたは横向きでタンパク質の透過反応を開始させ，高速AFMでその動態を観察する。高速AFMでの観察は100ミリ秒程度の時間分解能で測定可能である。タンパク質の透過反応は，数分で完了する反応であり，十分測定可能な時間である。高速AFM解析では，バッファーの状態によりタンパク質の挙動が大きく異なる。明瞭にタンパク質の透過反応を観察する為に，様々な条件で観察を進める必要がある。試行錯誤のうえ，最終的に観測データとＸ線結晶構造の情報とを組み合わせどのようにタンパク質が構造変化しながらタンパク質膜透過が起こっているのかを解明する。より詳細な情報を得るため，共同研究により結晶構造を本研究で得られる高速AFMの画像にフィットさせる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナなどの影響により、年度の後半で予定通り研究を進められないところがあったため次年度使用額が生じた。遅れた研究と合わせて、次年度に研究を進めていく。
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