2020 Fiscal Year Annual Research Report
不活性化Cas9によるゲノム不安定性誘導機構の解明とそれに基づく構造多型の操作
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19K22397
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
伊藤 隆司 九州大学, 医学研究院, 教授 (90201326)
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2019-06-28 – 2021-03-31
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| Keywords | dCas9 / CNV / 複製フォーク / ゲノム不安定性 / Rad52 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母ゲノム中では、CUP1遺伝子を含む2-kbのユニットが十数回縦列に反復している。我々は、CUP1にdCas9をターゲットすると、CUP1のコピー数が減少することを見い出した。このゲノム不安定性誘導機構の解明を目的に実験を行い、以下の成果を得た。
1)dCas9によるCUP1コピー数の減少は、ニコチンアミドによって加速された。この加速効果は、出芽酵母唯一のH3K56アセチル化酵素をコードするRTT109遺伝子に依存していた。ナノポアシーケンシングの結果、dCas9はCUP1アレイの短縮のみならず伸長も惹起できることが判明した。
2)dCas9をCUP1アレイの中心部に挿入したURA3カセットにターゲットすると、同カセットを欠失した5FOA耐性株の出現率が有意に上昇した。よって１分子のdCas9が結合するだけでCUP1アレイを不安定化することができることが示された。
3)dCas9によるCUP1アレイの不安定化は複製依存性であった。更に、２次元ゲル電気泳動法によって、dCas9結合部位周辺における複製フォークの停止が観察された。
4)遺伝子破壊株を利用した解析から、Replisome Progression Complexの構成因子であるCtf4とMrc1およびアクセサリーヘリケースRrm3が、dCas9によるCUP1コピー数減少に対して抑制的に働くことが示された。CTF4およびMRC1欠失株では２次元ゲル電気泳動で検出されるY-arc上の停止フォークスポットは減弱しており、複製フォークが不安定化したことの反映と考えられた。逆にRRM3欠失株では停止フォークスポットの増強が見られ、複製フォーク前方の障害物を排除できないためと考えられた。一方、RAD52およびRAD59の欠失株では、dCas9によるCUP1コピー数減少速度が減弱した。rad52欠失株を用いた相補実験からRad52はRad51非依存性にsingle-strand annealing活性を介して、この過程に関与することが判明した。
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