2019 Fiscal Year Research-status Report
核内転写因子集積点形成の１粒子ダイナミクスと機能解析
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19K22404
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
佐甲 靖志 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (20215700)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| Keywords | 転写調節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞は機能を発揮する遺伝子の組み合わせを変化させて様々に変化する。遺伝子発現を制御しているのは複雑な分子複合体であるが、中でもスーパーエンハンサーは、染色体上に遺伝子転写因子・転写制御因子が高密度に集積した構造であり、集団的な遺伝子発現制御を行うことによって、細胞運命決定等において主要な役割を果たす領域であるとして提唱されているが、その実体は明らかでなく機能についても依然として多くの議論がある。スーパーエンハンサー研究のほとんどは細胞を破壊して取り出した遺伝子解析手法による。本研究では生きた細胞内でスーパーエンハンサーの実体を直視し、同一細胞での遺伝子発現と直接関連づけることを目標とし、免疫B細胞の分化に関わる遺伝子発現調節において、NF-kBが核内に作る集積点形成と遺伝子発現との関わりを明らかにする。
本年度は、顕微計測法を確立して蛍光輝点形成のダイナミクス計測を行い、DT40細胞の分化刺激となる抗B cell受容体抗体の環境濃度に対するNF-kB集積点形成の応答関数を計測し、NF-kB核内濃度との相関解析を行った。その結果、集積点は核質濃度と正に相関して形成され、核質濃度上昇と集積点形成それぞれの中央値を与える抗体濃度は一致するが、集積点はNF-kBの核質濃度が低いとき相対的にできやすく、高濃度ではできにくくなるという興味深い結果が得られた。集積点はBRD4阻害剤で形成阻害され、K27アセチル化ヒストンやRNAポリメラーゼIIと共局在するなどから、転写開始点に存在していると考えられる。蛍光退色回復法により、集積点内のNF-kB分子が溶液分子と容易に交換すること、さらにヘキサンジオール処理で消失し、洗浄後に復活するなど、ルースな集合体であることも示唆されてきた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究は概ね順調に進行している。今年度計画の主要な部分はNF-kB集積点形成のダイナミクスを細胞内で可視化計測することであった。当初は主として全反射蛍光顕微鏡を使うことを予定していたが、ニポウディク型の共焦点蛍光顕微鏡が有効であることがわかり、観察・計測法の開発・確立を行った。この結果は実験技術として発表予定である(Wibisana et al. in prep.). 我々は以前に細胞質から核質へのNF-kB輸送が、細胞刺激抗体の濃度に対してスイッチ的に起こることを発表したが(Shinohara et al. Science 2014)、今回、集積点形成は核質濃度とはさらに非線形に関係しており、むしろ逆スイッチ的に形成されやすいという不思議な結果が示唆されてきた。一方で蛍光退色回復法やヘキサンジオール処理の結果は、NF-kB集積点は、いわゆる液液相分離状態のようなルースでダイナミックな相互作用で形成されていることを示唆している。これらの興味深い結果が得られてきたことは今後の発展につながる有用な成果である。
本研究のもう一方の柱は、遺伝子発現計測と集積点ダイナミクスの関係を明らかにすることである。概要には記述しなかったがこちらも準備が進んでおり、一細胞のATAC-seqやRNA-seqを開始している。2020年度には結果が得られ、画像解析結果と統合できると期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、今年度得られた画像解析結果を詳細に解析し、さらに遺伝子発現計測の結果を加味して、NF-kB集積点形成モデルを提案したい。ATAC-seqの結果からスーパーエンハンサー動態が推測可能になるはずであり、これを可視化計測結果と矛盾なく統合することを目指す。
スーパーエンハンサーが液液相分離構造をなしている可能性が報告され始めている。我々の結果も、NF-kBの集積点が液液相分離構造の特長である柔軟な分子間ダイナミクスを有することを示唆している。この結果を再確認して、その性質を詳細に明らかにすることと、溶液性ダイナミクスの生理的意義を提唱することが今後重要である。集積点の物理化学的性質を様々な顕微分光法で計測すると同時に、その生理活性を捉える方法を開発しなければならない。前者に関しては本年度行った蛍光褪色回復計測に加えて、蛍光相関分光法による分子数ゆらぎの計測や１粒子追跡法による周辺環境の粘弾性計測などを試みる。溶液中のNF-kB分子動態の計測（相関分光法で可能である）も行う。後者に関しては、まず遺伝子発現計測の結果から、NF-kB基点の生物学的機能を推定することが必要であり、その結果に基づいて可視化による機能計測法を考案する。
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| Causes of Carryover |
研究は順調に進行しているが、本年度はこれまでの研究データの解析と論文準備等に時間を取られたために、試薬・器具等の物品購入が予定よりも少なかった。また、年度末に予定されていた研究打ち合わせ、研究集会への出席等がキャンセルされたために旅費にも差額が生じた。差額は、来年度の研究予算（物品費・旅費）として使用する。
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