Analysis of intracellular gene transfer from chloroplasts to mitochondria

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K22405
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 小田原 真樹 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (40460034)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2022-03-31
• Keywords: 細胞内遺伝子移行 / 葉緑体 / ミトコンドリア

Outline of Annual Research Achievements

今年度はタバコ(Nicotiana tabacum)を用いた葉緑体からミトコンドリアへの細胞内遺伝子移行を1）マーカーによる選抜と2）レポーター発現の観察、により検出する系の構築を行った。1）に関しては、葉緑体における選択マーカーのaadAカセットとミトコンドリアにおける選択マーカーを葉緑体DNAに組み込むためのコンストラクトを作製した。このコンストラクトをパーティクルガンによってタバコに導入した。ジェノタイピングの結果、コンストラクトが葉緑体DNAに組み込まれたホモプラスミックなT0葉緑体形質転換体を取得することができた。また、この葉緑体形質転換体のT1世代も取得した。葉緑体からミトコンドリアへと遺伝子（ミトコンドリア選択マーカー）が移行したミトコンドリア形質転換体の薬剤選抜の条件検討を行い、葉切片からの再分化時と種子の発芽時それぞれにおける選抜条件を決定した。2）に関しては、葉緑体形質転換用マーカーであるaadAカセットと、ミトコンドリア特異的プロモーター下にレポーターとしてGFPを配置したコンストラクトを作製し、パーティクルガン法でタバコに導入した。ジェノタイピングの結果、コンストラクトが葉緑体DNAに組み込まれたホモプラスミックなT0葉緑体形質転換体を得た。ミトコンドリア発現レポーターが導入された葉緑体形質転換体の葉の観察を行ったが、現在のところミトコンドリアへの遺伝子移行を示すミトコンドリアからのGFPの蛍光は観察されていない

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通りに、葉緑体からミトコンドリアへの細胞内遺伝子移行検出系の構築を行うことができた。1）薬剤選抜による検出系に関しては、選抜に用いる薬剤が比較的低濃度でタバコの再分化や発芽を阻害し、選抜に用いることが確認できた。2）レポーターによる検出系に関しては、葉緑体ゲノムに導入したミトコンドリア発現レポーターが葉緑体内で発現しないことが確認できた。しかしながら、現時点でミトコンドリアゲノムへ遺伝子外交したことを示すレポーターの発現は見られていない。葉緑体からミトコンドリアへの遺伝子移行は低頻度で起きている可能性が高く、この結果は想定内である。

Strategy for Future Research Activity

１）選抜による検出系：作出した葉緑体形質転換体を用いて、葉からの再分化と種子を用いた発芽において、選抜条件下で薬剤に耐性を示す植物体を取得する。上記選抜により形質転換体候補が得られ次第、葉緑体からミトコンドリアへ移行したと考えられるマーカー遺伝子の同定を行う。
２）レポーターによる検出系：作出した葉緑体形質転換体を用いて引き続きレポーター発現の有無を観察する。葉のみならず様々な組織におけるレポーターの発現を観察する。
これらの検出系に関し、葉緑体からミトコンドリアへの遺伝子移行が促進される可能性のあるストレス処理等による効果も検討する。また、ミトコンドリアゲノムへ移行した遺伝子を検出する手法を確立する。

Causes of Carryover

初年度に計画していたサーマルサイクラーの購入を次年度に変更したため、助成金の一部を次年度へ繰り越した。