2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K22414
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
兵藤 晋 東京大学, 大気海洋研究所, 教授 (40222244)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神田 真司 東京大学, 大気海洋研究所, 准教授 (50634284)
高木 亙 東京大学, 大気海洋研究所, 助教 (90755307)
藤森 千加 東京大学, 大気海洋研究所, 特任研究員 (50750775)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 軟骨魚類 / 遺伝子導入 / 逆遺伝学 / トラザメ / 繁殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
軟骨魚類は進化、適応、繁殖など基礎生物学的にユニークかつ重要な現象をもつことに加え、海洋生態系の高次捕食者として保全や管理という観点からも極めて重要である。大型で遊泳力が高く、発生から繁殖までの期間が長い、ゲノムなど現代の生物学において必須の情報が少ないなどの課題があるものの、トラザメやゾウギンザメなどのモデル生物の開発、共同研究体制の構築により多くの課題を克服してきた。しかしながら、サメ研究には、遺伝子操作・逆遺伝学的解析ができないという、未だ致命的な手法的制約がある。本研究では、トラザメを対象に、年間を通して比較的多数の受精卵を使用できることや、エコー検査により初期卵を見出すことができるといったメリットを活かし、卵割初期卵や発生中の胚へのインジェクション、ウイルスやエレクトロポレーションなどを用いる遺伝子導入により、世界でも初めてとなる軟骨魚への遺伝子改変・逆遺伝学的解析に挑戦する。初年度の2019年度は卵に関する基礎的な知見を蓄積するため、これまで開発してきたエコー検査による受精卵の検出と、排卵前後に起こるホルモンの変動の解析、卵巣内に存在する大きさの異なる卵の形態学的・生化学的特徴の把握を行った。また、遺伝子導入技術の確立のため、トラザメ細胞の初代培養系を確立し、エレクトロポレーションやバキュロウイルスによる遺伝子導入法について検討した。さらに、卵だけでなく精子側に遺伝子を導入することを試みるために、精巣内において未分化な生殖細胞（精原細胞）の同定を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）エコー検査による受精卵の確認とステロイドホルモンの変動：簡易型のエコー検査を継続的に行うことにより受精卵の存在を確認し、並行して経時的な採血を行って性ステロイドホルモンを測定したところ、輸卵管内に受精卵が見つかる数日前にテストステロンの減少とプロゲステロンのサージが起こることを発見した。このことは、プロゲステロンが排卵等に関わることを示唆しており、人為的に受精卵を確保する手法の開発につなげられると考えている。
２）サメの初代培養系の確立と遺伝子導入：軟骨魚の体内には高濃度の尿素が含まれており、通常の哺乳類は魚類の培養系では適切な細胞培養ができない可能性が予想された。そこで体液組成を参考にして培養液を作製し、コラゲナーゼ反応時間などの条件検討も行った。その結果、コラゲナーゼで1時間処理した解離細胞をゼラチンコートした培養皿に播種し、20%FBS、尿素とNaClを高濃度に加えた培養液中で16度で培養したところ、細胞が培養皿に張り付き拡がるようになった。この培養系において、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、各種ウイルスによる感染法（アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス）によりGFP遺伝子を導入した。その結果、エレクトロポレーション法ならびにバキュロウイルスによる感染で細胞内にGFP蛍光が観察された。
３）精巣内の未分化生殖細胞の同定：精巣の組織切片を作製し、精原細胞の局在を調べた。その結果、精原細胞は精巣の中でも背側部に局在していることが明らかになり、今後遺伝子導入を行うための基礎的知見が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）生殖腺刺激ホルモンならびに性ステロイドホルモン投与の効果の検証：ホルモンを投与することにより排卵を促し、必要な時に受精直後の卵を得られるようになれば、効率的に遺伝子導入実験を行うことができる。そこで、生殖腺刺激ホルモンや性ステロイドホルモンを産卵直後の個体に投与し、排卵が起こるかどうか、もし排卵された場合には正常に発生が進行するかどうかを、エコー検査ならびに産卵された卵の発生を追跡することで明らかにする。
２）サメ培養細胞における遺伝子導入法の改善：2019年度の研究により、初代培養細胞にGFP遺伝子を導入して蛍光を確認することができた。しかしながらその確率はまだ低い。そこで、エレクトロポレーション法とバキュロウイルス法に焦点を絞り、培養条件や濃度などの条件検討を行うことで、最適の遺伝子導入方法を確立する。サメ胚へのvivo-モルフォリノ投与によるノックダウン実験も進める。
３）精巣内の精原細胞への遺伝子導入の試み：受精卵に遺伝子導入を行う場合、一度に1個体あたり受精卵2個が最大であり、体内から取り出す必要がある。そこでもうひとつの方法として、精原細胞に遺伝子導入することを試みる。2019年度に明らかにした精巣背側部の精原細胞が局在する領域を取り出して初代培養を行い、上記２）で確立する手法で遺伝子導入を試みる。
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| Causes of Carryover |
ノックダウンの予備実験に予定よりも時間がかかってしまい、本実験は来年度に行うこととした。年度末に行う予定だった遺伝子導入実験も、活動制限により一部来年度に持ち越さざるを得なかったため、これらにかかる分子生物学用試薬を来年度に繰り越した。一方で、エコー検査とステロイドホルモンに関する研究は想定以上の成果が得られたため、研究全体としてはおおよそ想定どおりの成果が得られた。来年度は分子生物学用の消耗品費等に多くの費用を使用する計画である。
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