2020 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation and characterization of a novel starvation-response in animals controlled by nucleic-acid molecules
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19K22418
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
増田 真二 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (30373369)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 緊縮応答 / ppGpp / Mesh1 / ショウジョウバエ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ショウジョウバエを主な材料とし、未知の動物型ppGpp合成酵素遺伝子を単離すると共に、ショウジョウバエの視細胞におけるppGppの機能を詳細に調べることで、既知のラパマイシン標的タンパク質(TOR)やインスリン様成長因子(IGF)のシグナルとは独立した、動物の新たな恒常性維持・栄養応答機構の存在を実験的に証明することを目的に研究を進めている。今年度の実績を以下に記す。
1)動物型ppGpp合成酵素の単離実験
試験管内でppGpp分解活性を示す酵素Mesh1が後生動物から同定されているが、既知のppGpp合成酵素遺伝子は動物のゲノム上に見つからない。大腸菌の相補実験により、未知の動物型ppGpp合成酵素遺伝子の同定を目指した。具体的には、大腸菌のppGpp合成欠損株(relA-spoT二重変異体)に、マウスのcDNAライブラリーをランダムに導入し、最小培地で生育できない表現型を相補したサプレッサー株の単離を試みている。 昨年度に引き続いたスクリーニングに加え、今年度は単離したサプレッサーのバッククロスを順次進め、候補の遺伝子の絞り込みを行った。しかし、今のところppGpp合成活性を明確に示す候補遺伝子の同定には至っていない。
2)組換えショウジョウバエの作成と解析
昨年度より、目特異的なGMRプロモータ依存で枯草菌のppGpp合成酵素YjbMを発現するラインを調べ、Mesh1変異がppGpp蓄積に及ぼす影響を調べた。この実験により、ppGppの高蓄積が細胞死を誘導することを見出すことに成功した。この成果を論文にまとめ投稿したところ、査読後に、より詳細なppGpp定量の結果の記述を求められたため、今年度は、MS/MS解析で検出されるppGppのフラグメントのより詳細な解析を行った。その結果を含め、Comm. Biol.誌に一連の成果を発表することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、サプレッサー変異体を通じたppGpp合成酵素の単離には至らなかったものの、これまでの成果を論文として発表することができたことが、上記自己評価の主な理由である。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度も、大腸菌のサプレッサー変異体の単離実験を継続して行うが、この実験はかなりリスクが高いことを踏まえ、ショウジョウバエのMesh1変異体の遺伝学的解析も同時に進める。具体的には、Mesh1が最近、ppGpp分解活性だけではなく、NADPHの脱リン酸化活性をも有することが報告されたため（Nat. Metab. 2: 270)、Mesh1変異体で見られた表現型が、どちらの活性の欠損によるものなのかが明らかになっていない。そこで、Mesh1の結晶構造を基に、NADPHの脱リン酸化には必須だが、ppGpp分解には必要なさそうなアミノ酸を予想し、そのアミノ酸に部位特異的変異を導入することで、NADPHの脱リン酸化活性のみを欠損した変異Mesh1を遺伝学的・生化学的に見出す。見出した変異Mesh1遺伝子をショウジョウバエのMesh1変異体に導入することで、Mesh1のppGpp分解活性の生理機能を遺伝学的に調べることを試みる。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の影響により、予定されていた実験が思うように進まず、消耗品の購入が大幅にずれ込んだため。また学会が中止になり、旅費の支出もずれ込んだため。
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