2019 Fiscal Year Research-status Report
生体膜での脂肪酸ナノスケール解析技術確立による不飽和脂肪酸生理機能発現機序の解明
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19K22435
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
藤田 秋一 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (60282232)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
正谷 達謄 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (70614072)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| Keywords | 電子顕微鏡 / 脂質 / 微細分布 / 微細構造 / 生体膜 / フリーズフラクチャー / 急速凍結 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは脂質の超微局在を明らかにすることが、膜脂質の機能を解明するために必須であると考え、そのための方法開発に注力してきた。その結果、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法（QF-FRL: Quick Freezing & Freeze-fracture Labeling）によって膜脂質を特異的に標識することが可能であることを示し、生体膜脂質の二次元的分布をナノレベルで定量的に解明することに成功した。このQF-FRL法が識別するのは糖鎖、イノシトール環など、膜脂質の“親水性頭部”の違いであるのに対し、膜脂質の多様性のもう一つの要因である“疎水性尾部”の違いを明らかにすることは原理的に困難であった。本研究では、現在用いているQF-FRL法をさらに改良することにより、凍結レプリカ脂肪酸標識法を新たに改良し、生体膜における脂肪酸分布をナノレベルで解析することを可能にする。
哺乳類培養細胞あるいは培養組織の培養液中にアルキン化不飽和脂肪酸を入れ細胞内に取り込ませ、そのアナログが本来の内在性脂質と同様の性質を持つことを確認し、そしてクリックケミストリー法により不飽和脂肪酸を標識することができた。標識方法を確立するために、まず蛍光標識法で行い光学顕微鏡を用いて解析し、最適な条件を確定した。具体的には、市販されているアルキン化オレイン酸（１価不飽和脂肪酸）を用いて培養細胞において蛍光標識することに成功した。アルキン化オレイン酸を哺乳類培養細胞に取り込ませた後、アルデヒドで固定しbiotin-azideと反応させることにより、蛍光標識を得ることができた。培養組織における不飽和脂肪酸の標識には、培養細胞と同様の方法を用いたが、外来性に投与した不飽和脂肪酸の浸透性が悪く、明確な不飽和脂肪酸の局在を追えることが出来なかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、計画していた培養細胞および組織標本において、アルキン化不飽和脂肪酸を培養液中に入れて、細胞あるいは組織細胞内に取り込ませた後、蛍光標識法によって、細胞内での不飽和脂肪酸の局在を観察することに成功した。今後は、アルキン化不飽和脂肪酸を取り込ませた培養細胞を急速凍結し、凍結割断レプリカを作成して、レプリカ膜上での不飽和脂肪酸の標識を電子顕微鏡を用いて観察する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究では、脂肪酸分布解析技術開発のため、脂質の脂肪酸領域を露出することができる凍結レプリカ脂肪酸標識法を開発・確立する。基本的に従来の急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法を応用し、凍結割断後、エッチングすることでリン脂質の親水性頭部に面した氷を昇華させることにより親水性頭部を露出させる。その後、白金と炭素を蒸着すると疎水性の脂肪酸がむき出しになったレプリカ薄膜が形成される。レプリカ膜上での脂肪酸標識にはクリックケミストリー法を用いる。
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| Causes of Carryover |
脂肪酸の微細分布を観察する際に用いる、急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法では、培養細胞を加圧凍結装置が不可欠であったが、不具合があったためしばらくの間使用が困難な状況にあった。そのため、QF-FRL法によるレプリカ膜上での脂肪酸標識が出来なかったため、助成金の不使用分が生じた。現在は加圧凍結装置の修理を行い、不具合も解消したために、QF-FRL法による脂肪酸のナノスケールでの分布解析のための諸経費に用いる。
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[Journal Article] Phosphatidylinositol 4-phosphate on Rab7-positive autophagosomes revealed by the freeze-fracture replica labeling2019
Author(s)
Kurokawa, Y., Yoshida, A., Fujii, E., Tomioku, K., Hayashi, H., Tanabe, K., Fujita, A.
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Journal Title
Traffic
Volume: 20
Pages: 82-95
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Essential and distinct roles of phosphatidylinositol 4-kinases, Pik1p and Stt4p, in yeast autophagy2019
Author(s)
Kurokawa, Y., Konishi, R., Yoshida, A., Fujii, E., Tomioku, K., Futagami, T., Tamaki, H., Tanabe, K., Fujita, A.
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Journal Title
Biochim. Biophys. Acta. Mol. Cell Biol. Lipids.
Volume: 1864
Pages: 1214-1225
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Predominant localization of phosphatidylserine at the cytoplasmic leaflet of the ER, and its TMEM16K-dependent redistribution2019
Author(s)
Tsuji, T., Cheng, J., Tatematsu, T., Ebata, A., Kamikawa, H., Fujita, A., Gyobu, S., Segawa, K., Arai, H., Taguchi, T., Nagata, S., Fujimoto, T.
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Journal Title
Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.
Volume: 116
Pages: 13368-13373
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Nanoscale analysis reveals no domain formation of glycosylphosphatidylinositol-anchored protein SAG1 in the plasma membrane of living Toxoplasma gondii2019
Author(s)
Kurokawa, Y., Masatani, T., Konishi R, Tomioku, K., Xuan, X., Fujita, A.
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Journal Title
Histochem. Cell Biol.
Volume: 152
Pages: 365-375
DOI
Peer Reviewed
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