2020 Fiscal Year Research-status Report
２つの細胞系譜で独立に遺伝子操作を行い細胞自律的・非自律的効果を解析する技術開発
| Project/Area Number |
19K22436
|
|---|
| Research Institution | Kyorin University |
|---|
Principal Investigator |
粟崎 健 杏林大学, 医学部, 教授 (60359669)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 健太郎 杏林大学, 医学部, 講師 (30733068)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
|
| Keywords | 細胞系譜 / ショウジョウバエ / 部位特異的組換え / グリア |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、キイロショウジョウバエで開発された既知の遺伝学的解析技術を巧妙に組み合わせることで、「2種類の異なる親細胞に由来する細胞集団で独立に遺伝子操作を行い細胞自律的・非自律的効果を同時に解析する技術」を開発することである。本研究では、成虫脳ニューロピルグリアを作り出す２つの細胞系譜、「L-EG細胞系譜」と「gcm細胞系譜」それぞれを独立に空間的かつ時間的細胞操作を行う遺伝操作システムの確立を目指す。本年度は昨年度同定したエンハンサー配列を元に、GeneSwitch(GS)-GAL4, GeneSwitch(GS)-LexA系統を作成することであった。そのために、同定したエンハンサー配列を元に、（１）特定のランディングサイトにおいてgcm-GAL4とL-EG-LexAを作成し、発現を確認した上で（２）gcm-GS-GAL4とL-EG-GS-LexA を作成することを計画した。本年度は、他のグループの研究報告を参考に、当初計画になかったdDHFRのDestabilizing Domain (DD)を利用した、薬剤による遺伝子発現誘導システムについても利用を検討し、GAL4-DDならびに、LexA-DDの遺伝子構築を行なった。（１）について、ハエ系統を作成し確認したところ、残念なことに、ランディングサイトを変えたことにより、発現パターンが変わってしまい、利用できなるエンハンサーがあることがわかった。ランディングサイトによる影響を考慮すると、むしろはじめからenhancer-GS-GAL4(LexA)やenhancer-GAL4(LexA)-DDを複数のランディングサイトに挿入した系統を作成して、有用なものをスクリーニングした方がより効率的に実験ができるのではないかとの考えに至り今後はその方向で研究を進めることとした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は新型コロナ感染症蔓延防止のための緊急事態宣言等により、実験実施制限があったため、数ヶ月間にわたり実験ができない期間があり、その分研究が遅れた。エンハンサー活性の確認のために、X染色体上のランディングサイトに３種類のgcm-GAL4を持つ系統の作成を試み、たが得られた系統をこのまま実験に使用することは難しいという結論に達した。ゆえにこれらについては、オリジナルのGAL4系統が挿入していた第３染色体のランディングサイトを利用することに変更することとした。また、L-EGについては、EGと一部のgcm-positive細胞で発現している系統を得ることができた。EGと一部のgcm-positive細胞については、薬剤による発現誘導をgcm細胞が誕生するより若いステージの幼虫に限定することでL-EG細胞系譜特異的なラベルに利用することが可能であると考えた。それゆえに、GeneSwitch とdDHFRのDestabilizing Domain (DD)を利用した２種類の薬剤による遺伝子発現誘導系を利用することを考え、遺伝子構築を行なった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
まず、これまでの解析結果をもとに、L-EG-LexA-DD, L-EG-LexA-GeneSwitch(GS), gcm-GAL4-DD, gcm-GAL4-GS系統を作成し目的とする細胞でリコンビネースを発現誘導する系を完成させる。現在までに作成中のUAS-FLP-DD, UAS-FLP-GS, lexA-op-KD1-DD, lexA-op-KD1-GS、Act-KOT-LexAの遺伝子構築を完成させてハエ系統を作成し、２つの細胞系譜同時ラベルを行うのに必要なトランスジーンのアッセンブルを行う。
必要なトランスジーンを持つハエを作成した後、GSについてはRU486(mifespristone)、 DDについてはTMP(Trimethoprim)この２つの薬剤を加えるタイミングと量を実験的に検討して２つの細胞系譜同時ラベルに最適な条件を見出す。
薬剤による誘導がうまくかからなかった場合には、片方の細胞系譜のラベルについては、既存の熱ショックを利用した方法と組み合わせることも検討する。
|
| Causes of Carryover |
DNA構築とハエ系統作成に遅れが生じたため、次年度へ繰り越した。今年度たくさんのハエ系統を作成する必要があり、その受託のための経費ならびに、DNA合成のための経費に繰り越した予算を使用する予定である。
|
