2020 Fiscal Year Research-status Report
mRNAでオンになるスイッチ分子の開発と脳発生解析における応用
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19K22441
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
下向 敦範 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 専門職研究員 (00442971)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | mRNAターゲティング / Cas13 / 分子スイッチ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Cas13の不活性型は、狙ったmRNAに結合する事が可能であり、mRNAの編集や、可視化に利用されている。そこで、二つのCas13に分割した転写因子を融合し目的のmRNAの存在 によりスイッチをオンする分子の開発を試みた。
前年度の作成した、スイッチのプロトタイプを元に、ターゲットのRNAがなくても、発現のリークが見られたことから、これらを減らす事を試みた。分割したインテイン部分とCas13タンパク質を接続するリンカー部分は、インテインに近く、インテインの再構成に影響と与えると考え、リンカーの長さの変更、アミノ酸の荷電、疎水性について変更を加え、最終的なレポーターの発現を指標に影響を評価し、改善を試みた。その結果、アミノ酸の電荷がレポーターの活性に影響を与える事を見出したが、バックグランドの改善は見られなかった。また、バックグランド上昇の原因として、分裂時において、核内と核外への局在の分離が核膜崩壊により妨げられている可能性が示唆された。また、コロナウイルスによる感染拡大による研究施設の一時的ロックダウンにより、研究への時間が思うように確保できなかったため、研究期間の1年の延長を行い目標の達成を目指す。バックグランドシグナルの対策として、分裂後の神経細胞をターゲットとすること、分解シグナルの負荷による余計な相互作用の軽減、ケージドタイプのインテインの導入などにより改善を図る予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年度の作成した、スイッチのプロトタイプを元に、ターゲットとなる5'UTRを持つ人工的なターゲットを発現した状態に再構成されたTetON転写因子に対するレポーター下に接続したEGFPを指標に、ターゲットgRNAの有無でコントロールを取り、マウス胎児脳を用いて、E13に導入し、3日後にドキシサイクリンを腹腔投与して、8時間後にレポーターの発現を免疫染色で評価した。様々なリンカーを試した結果、塩基性のアミノ酸配列を加えることによって、全体的にレポーターの活性が上がる事、また、酸性のアミノ酸は、活性を著しく阻害することがわかった。しかしながら、バックグランドの上昇も伴うことから、活性を維持しつつ、バックグランドを下げる改良が必要であると考えられる。また、核内と細胞質での区分けシステムが、分裂細胞において、混ざり合い、バックグランドの要因の一つであることを示唆するデータが得られた、そのため、分裂後の神経細胞をターゲットとして想定する。コロナウイルスによる感染拡大による研究施設の一時的ロックダウンにより、研究への時間が思うように確保できなかったため、研究計画を一年延長して、さらに改良をおこなう。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、バックグランドの改善を試みる。対策としては、非特的再構成を抑えた、cagedインテインの導入、塩基性とリンカーと酸性リンカーの複合の検討、さらには、分解シグナルを孵化することにより、バックグランドシグナルの減少を試みて、特異性をあげることに専念する。また、マウス胎児脳だけでなく、HEK293細胞を用いて、活性の普遍性の確認と、バックグランドが解消できた場合、実際の遺伝子をターゲットにして、発生中期にツールの導入をおこない、生後6日後において、特定の層の神経がどの程度特異的にラベルできるかによって、最終評価を行いたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
コロナによる研究所のロックダウンの影響もあり、研究時間の確保が十分でなかったために、計画を１年延長することにした。そのため、消耗品の費用として、少額を残り、残りはすでに購入済みの試薬を用いて、研究を継続する予定である。
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