Testing the evolutionary conservation of miRNA-target pairs identified by a new exhaustive method

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K22460
• Research Institution: Tokyo Metropolitan University
• Principal Investigator: 野澤 昌文 東京都立大学, 理学研究科, 准教授 (50623534)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2022-03-31
• Keywords: miRNA / ショウジョウバエ / 大規模シーケンス / 遺伝子発現

Outline of Annual Research Achievements

昨年度に引き続き、おもにキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）を用いてmiRNAと標的遺伝子のペアを効率的にシーケンスする方法の改良を試みた。いくつかの条件で抽出したサンプルからそれぞれライブラリ作成を行い、実際にショートリードシーケンスを行った。しかし、いずれの条件においても、得られたリードのうちmiRNAと標的遺伝子がペアになっているリードはごくわずかであり、手法の確立には至らなかった。
そこで、次年度以降に行う種間比較で使用予定であるショウジョウバエ1種の高精度ゲノム配列の決定に着手した。まず、オスから抽出したDNAを用いてナノポアロングリードシーケンス（Oxford NanoPore MinION）を行った。次に、雌雄それぞれから抽出したDNAを用いてショートリードシーケンス（Illumina HiSeqX）を行った。現在、ゲノムアセンブリを行い、ショートリードをゲノムにマッピングした雌雄の読取深度の比から、常染色体、X染色体、Y染色体配列の分類を試みている。
また、上記手法が確立できない場合に備えて、キイロショウジョウバエのmiRNA過剰発現変異体と野生型個体のRNA-seqから発現変動遺伝子を網羅的に同定し、miRNA-標的遺伝子ペアを網羅的に予測するという手法の準備を進めた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

新型コロナウイルスの影響で、特に4～9月にかけて、大学への出入りが強く制限されたため。この期間は学生もほとんど大学に来ることができず、実験に費やせる時間が著しく減少した。10月以降も研究室の密度をコントロールするために人数制限をかけていたため、十分な条件検討を行うことができなかった。

Strategy for Future Research Activity

最終年度も、引き続きmiRNA-標的mRNAペアの抽出法を確立し、シーケンスまでひと通りおこなう。また、上記の手法確立が難航する場合を考慮し、キイロショウジョウバエの変異体を用いたmiRNA-標的遺伝子ペアの同定も並行して行う。
当初の目的であった「ショウジョウバエの進化過程でmiRNA-標的遺伝子がどのように変化してきたのかを明らかにする」ところまで到達するのは難しいかもしれないが、何とかmiRNA-標的mRNAペアの網羅的同定法を確立して今後のmiRNA研究に貢献できればと考えている。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの影響で、miRNA-標的遺伝子ペアの同定法に関する十分な実験を行えなかったため。