2020 Fiscal Year Research-status Report

新規化学遺伝学ツールによる脳機能回復戦略の研究

Research Project

Project/Area Number	19K22474
Research Institution	Fukushima Medical University
Principal Investigator	小林和人福島県立医科大学, 医学部, 教授 (90211903)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2022-03-31
Keywords	化学遺伝学 / 神経活動促進 / 機能回復 / パーキンソン病 / 認知症
Outline of Annual Research Achievements	近年、本国は「超」高齢社会に突入し、脳の老化と関連深い神経疾患の増加は喫緊の社会問題である。これらの疾患は脳内の特定の神経細胞の編成と関連し、この細胞変性を抑制する、あるいは、その機能低下を補償する技術が治療に結び付く可能性がある。最近、昆虫の興奮性イオン透過型受容体を利用して目的の神経細胞種の活動を選択的に促進させる新規の化学遺伝学的技術の開発に成功した。昨年度、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いてIR84aとIR8a 受容体遺伝子を標的細胞において選択的に発現させる誘導系の構築に取り組んだ。このベクター系において組換え反応を介して、ある程度の神経細胞で2種類の受容体遺伝子の発現することに成功したが、AAVベクターでは2種類のベクターが共発現する細胞においてのみ、機能的な受容体が形成されるため、導入の効率に課題があった。本年度は、レンチウイルスベクターにGFP-IR84a-2A-IR8a(HAタグ)を搭載し、このベクターをドーパミンD2受容体 (D2R)遺伝子のプロモーターの制御下にCre を発現するトランスジェニックラット系統の線条体に注入することによって機能的な受容体遺伝子の高頻度な発現を誘導する実験系を樹立した。また、6-ヒドロキシドーパミン (6-OHDA)処理によってパーキンソン病モデルラットを作製し、ドーパミン細胞の部分的な変性を誘導した。この動物は、聴覚弁別課題において、学習初期の正答率が低下するが、訓練を継続することによって、学習の後期に正答率が正常レベルに回復することを見出した。中脳黒質の部分変性による学習障害は訓練を継続する過程で何らかの補償機構によって回復することが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年度、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いてIR84aとIR8a 受容体遺伝子を標的細胞において選択的に発現させる誘導系の構築に取り組んだ。このベクター系において組換え反応を介して、ある程度の神経細胞で2種類の受容体遺伝子の発現することに成功したが、AAVベクターは搭載できる導入遺伝子のサイズが限られるため、２つの受容体遺伝子を別々のベクターに搭載し、2種類のベクターが共発現する細胞においてのみ、機能的な受容体が形成されるため、導入の効率に課題があった。そこで、レンチウイルスベクターに切り替え、IR84aとIR8a 受容体を2Aペプチドで連結した融合遺伝子として発現させる実験系の開発に取り組んだ。IR84aにはGFPを融合し、IR8aにはヘマトアグルチニン(HA)のタグを融合し、できるだけ短い導入遺伝子サイズになるように設計した。この融合遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターをドーパミンD2受容体 (D2R)遺伝子のプロモーターの制御下にCre を発現するトランスジェニックラット系統の線条体に注入し、両受容体遺伝子がD2R陽性細胞に高頻度に発現することを確認した。次に、パーキンソン病モデルラットを作製するために、適当量の6-ヒドロキシドーパミン (6-OHDA) を線条体に注入し、ドーパミン細胞の部分的な変性を誘導したモデル動物を作成した。この動物を用いて2種類の音刺激(10Hzと2Hz)を聞き分け、左右のレバーを押し分ける聴覚弁別課題をテストした。6-OHDA処理ラットは、正常動物に比較して、学習初期の正答率が低下するが、訓練を継続することによって、学習の後期において正答率が回復することが明らかとなった。このことは、中脳黒質の部分変性による学習障害は訓練を継続する過程で何らかの補償機構によって回復することが示唆された。
Strategy for Future Research Activity	2021年度は、パーキンソン病モデルラットを利用し、中脳ドーパミン神経細胞の機能亢進による運動障害の改善を試みる。TH-Creラットを用いて、ドーパミン細胞に対する神経毒である6-ヒドロキシドーパミン (6-0OHDA) を線条体に注入し、ドーパミン細胞の部分的な変性を誘導し、聴覚弁別課題の低下を示すモデル動物を作成する。この動物の中脳にGFP-IR84a-2A-HA-IR8a遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを注入し、ドーパミン細胞選択的に受容体複合体を誘導する。さらに、末梢からリガンド前駆体であるメチルフェニル酢酸（MPhAc）を投与することによって、MPhAcを脳内に移行させ、エステラーゼの作用によってPhAcに変換し、脳内の受容体を活性化させる。この作用によってドーパミンニューロンの活性化を誘導する。ドーパミンニューロンの活性化についてはマイクロダイアリシス法により、線条体におけるドーパミンの遊離を確認する。対照群に比較してパーキンソン病モデルの学習機能の低下を回復できるかどうかを解析する。
Causes of Carryover	本年度作成したTH-Creラットについて、TH発現レベルやカテコールアミン代謝系を調べる必要が生じたため。