2020 Fiscal Year Research-status Report
生体内において自由自在にNotchシグナルの強弱を変化させる分子ハンドルの創生
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19K22490
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
竹内 英之 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (80361608)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | O-グルコース糖鎖 / Notch シグナル / 糖転移酵素 / ケミカルバイオロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Notch シグナル伝達経路は、進化的に非常によく保存された、多細胞生物個体における細胞の運命決定に重要な役割を果たす細胞間情報伝達経路である。例えば、ショウジョウバエでは神経細胞や翅の発生分化、また、哺乳類においては、発生過程の体節形成、胸腺における T 細胞分化や腸管上皮幹細胞の自己複製と分化など、様々な生物学的プロセスを制御している。また、Notch シグナルの破綻は癌の発生、悪性度の進展、転移に関わっている。多くの種類の癌で Notchシグナルの異常な亢進が観察される一方、急性骨髄性白血病や扁平上皮癌など、ある種の癌では、Notch シグナルの低下が発癌と悪性度の進展に関与している。
研究代表者は、Notch の細胞外部位における糖鎖修飾が、その活性化に重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。O-グルコース糖鎖の付加は、Notch の活性化に必須である一方、O-グルコース糖鎖のキシロースによる伸長は、Notch の活性化を抑制する。肺、食道、および頭頸部由来扁平上皮癌を含む、多くの癌で XXYLT1 の増幅がみられ、このことが発癌に関与している可能性がある。本研究では、O-グルコース糖鎖合成を担う糖転移酵素に照準を定め、それらの低分子阻害薬を探索する。
このような目標を達成するために、本年度は、タンパク質O-グルコース転移酵素POGLUT1を対象として、化合物ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニングのアッセイ系を構築した。さらに、キシロース転移酵素の活性が、同様のアッセイ系で測定できることも確認した。
Notch受容体機能の糖鎖修飾による制御機構に関する原著論文4報、並びに、英文総説1報の発表に貢献した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
タンパク質O-グルコース転移酵素POGLUT1を対象として、東京大学創薬機構の支援を受け、化合物ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニングのためのアッセイ系を構築した。このためには、糖転移酵素、UDP-グルコースなどのドナー糖ヌクレオチド、EGF リピートなどのアクセプターからなる in vitro での糖鎖付加反応系を確立する必要があった。HEK293T 細胞に発現ベクターを一過性導入し、培地を採取し、Ni-NTA アフィニティークロマトグラフィーで糖転移酵素を精製することにより、組換えヒトPOGLUT1タンパク質を発現、精製した。また、pET大腸菌発現系を用いて、O-グルコースコンセンサス配列を有する、マウスNOTCH2EGF12に相当するEGFリピートを発現させ、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーおよび逆相(RP)HPLCによりさらに精製した。最後に、RP-HPLCおよびLC-MSを用いた反応産物の分析により、EGFリピートがin vitro での糖鎖付加反応で糖転移酵素POGLUT1によりO-グルコース糖鎖で修飾されていることを確認した。そして、約1万化合物のスクリーニングを行い、POGLUT1に対して阻害作用を示す約50種類の化合物を得た。一方、興味深いことに、POGLUT1の酵素活性を亢進させる化合物も2種類得た。
さらに、三次元立体構造解析のためのグルコシドキシロース転移酵素 GXYLT1 の作製も上と同様の方法で行った。また、POGLUT1の酵素活性測定系が、本酵素についても適用可能であることが確認された。しかしながら、化合物スクリーニングの実施には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ここまでに構築した化合物ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニング系を用いて、Notch受容体を修飾する糖転移酵素POGLUT1、GXYLT1、GXYLT2、XXYLT1の阻害剤候補をさらに探索する。最初のスクリーニングでPOGLUT1に対して阻害活性が見られた化合物については、培養細胞を用いた Notch レポーターアッセイを行う [Rana et al. 2011 J Biol Chem]。Jafar-Nejad 博士がショウジョウバエ個体を用い Notch シグナルに対する影響を調べる [Lee et al. 2017 Plos Genetics]。
既報と同様に、作製したGXYLT1の基質との複合体の結晶構造解析を遂行する [Yu、 Takeuchi et al. 2016 Nat Chem Biol] [Takeuchi (correspondence)et al. 2015 Nat Chem Biol]。
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| Causes of Carryover |
Notch 受容体を修飾する糖転移酵素 O-グルコース転移酵素 (POGLUT1) を標的とする、当初予定していた化合物ライブラリーを用いた阻害剤の探索の開始に、想定よりも長い時間がかかった。一方で、糖転移酵素の反応基質である上皮増殖因子様 (EGF) ドメインタンパク質の種類の選定に、予想よりも少ない数の実験施行で、スクリーニングに適したものを選定することができ、さらに、より 1 プレートあたりのウェル数の多い 1,536 ウェルを用いたアッセイ系を構築することで、高効率にスクリーニングを行うことができたために、結果として、当該次年度使用助成金が生じた。
今後、POGLUT1 に加えて、キシロース転移酵素を標的とし、反応効率の良い EGF 基質を用いた阻害剤探索を加速させていく計画である。
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