改変ヘルペスウイルスLAT発現系による恒久的治療遺伝子供給システムの構築

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K22505
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 宮川 世志幸 日本医科大学, 医学部, 講師 (90415604)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2023-03-31
• Keywords: ヘルペスウイルス / CRISPRa / インシュレーター

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、無毒化ヘルペスウイルス（HSV）ベクターシステムにおいて恒久的遺伝子発現系を構築し、治療遺伝子発現に利用することで、次世代型の遺伝子治療ベクターを開発する。前年度までに開発した改変CRISPR/dCas9/sgRNA発現系を挿入した組換えHSVベクターを作製し、恒久的遺伝子発現が実現可能か評価することを目的としていた。また同時に前年度に引き続いてsgRNA発現カセットの至適化についても進め、効率的な転写活性化を達成可能な発現系の開発も推進することを予定していた。前年度の構築まで完了していたLAT領域にGatewayシステム組換え配列を挿入したHSV-GWベクターを用いて、HSV 恒常的転写活性領域であるゲノム領域LAT及びCAGプロモーターを標的化したsgRNA発現系及びdCas9発現系を搭載した組換えHSVを作製した。シークエンス解析、ウイルスゲノム構造解析を行った結果、無毒化HSVのL AT領域に正しく挿入されていることを確認した。また同ベクターは無毒化HSVベクター専用のウイルス産生細胞にて効率よく増殖することが明らかとなった。本CRISPRシステムによりLAT領域及びCAGプロモーターを標的化可能か調べるために、LAT領域及びCAGプロモーターにレポーター遺伝子GFPを連結した無毒化HSVを調整し、ヒト線維芽細胞に対する共感染実験を実施した。現在、無毒化HSVベクターからの遺伝子発現を最大限に向上させるsgRNAの組み合わせ及び最適なベクター量について複数の実験系を用いて条件検討を続けている。

Research Products

• [Journal Article] Evaluation of parameters for efficient purification and long-term storage of herpes simplex virus-based vectors (2022)
  • Author(s): Kuroda Seiji、Miyagawa Yoshitaka、Sukegawa Makoto、Tomono Taro、Yamamoto Motoko、Adachi Kumi、Verlengia Gianluca、Goins William F.、Cohen Justus B.、Glorioso Joseph C.、Okada Takashi
  • Journal Title: Molecular Therapy - Methods & Clinical Development Volume: 26 Pages: 132～143
  • DOI: 10.1016/j.omtm.2022.06.007
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] The functional analysis of human mesenchymal stem cells for cancer gene therapy. (2022)
  • Author(s): Makoto Sukegawa, Yoshitaka Miyagawa, Seiji Kuroda, Motoko Yamamoto, Kumi Adachi, Nobuhiko Taniai, Hiroshi Yoshida, Akihiro Umezawa, Mashito Sakai, Takashi Okada.
  • Organizer: The 45th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (MBSJ2022).
• [Presentation] Impacts of purification and storage methods on the yield and functionality of oncolytic herpes simplex virus. (2022)
  • Author(s): Seiji Kuroda, Yoshitaka Miyagawa, Makoto Sukegawa, Yuriko Sato, Yuka Oyama, Motoko Yamamoto, Kumi Adachi, Mashito Sakai, Goins WF, Cohen JB, Glorioso JC, and Takashi Okada.
  • Organizer: The 28th Annual Meeting of Japan Society of Gene and Cell Therapy (JSGCT2022).