2019 Fiscal Year Research-status Report
中枢型トリプトファン水酸化酵素のエクソン・スキップによる翻訳抑制解除と創薬
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19K22581
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
廣井 朋子 聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 講師 (20238398)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
那和 雪乃 聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 助教 (10549786)
大滝 正訓 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (20612683)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| Keywords | TPH2 / エクソン・スキップ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト中枢型トリプトファン水酸化酵素(TPH2)の、エクソン2の領域を中心に、上下のイントロンから各300塩基程度を含むようにプライマーを設計した。pBluescriptに挿入するにあたり、In-Fusionクローニング法(Clontech-タカラバイオ)を用いるため、設計したプライマーの両端に15塩基のpBluescript由来の配列を付け足して合成し、市販のヒトgenomic DNAを鋳型としてPCRを行った。pBluescriptに挿入されたエクソン2を含む断片を基に、QuikChangeTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (アジレント・テクノロジー) を用いてエクソン2内の2塩基を置換し、中央部にストップコドンを作成した。変異の導入は、制限酵素切断断片の変化および塩基配列解析により確認した。
また、今後の実験に用いるポジティブコントロールとして、pCMV-scriptにルシフェラーゼ(ATGを含む)を挿入したものを作成し、ルシフェラーゼアッセイにて発光を確認した。
別方向からのアプローチとして、エクソン2由来のアミノ酸部分を取り除いた欠失型TPH2(delTPH2)及び欠失なしTPH2(wtTPH2)の立体構造をコンピューター上でシミュレートした。C末端側から342残基の部分は、Biopterin Hとして結晶構造が解かれている部分（PDB:4v06）であるため、これを鋳型とし、Modeller9.19を用いて、ホモロジー・モデリングにより構造を予測した。wtTPH2とdelTPH2で異なるN末端側の構造については、本方法では予測できなかったが、少なくとも酵素活性部位についてはほぼ同一の構造であると予測された。このことから、delTPH2もトリプトファン水酸化酵素としての活性をもつことが期待できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
令和元年の7月に、学内新設予定部署の新居室とするために、本研究を実行している研究施設の面積を半分にする縮小工事が行われることが決まった。そのため、何十年も使用してきた実験室の片付けが必要となり、備品や機器の廃棄および移設、実験台の片付けと内容物の廃棄および移設、書類やマニュアル等の整理縮小、居室の引っ越しなど、本研究へのエフォートがゼロとならざるを得なくなった。また、工事期間中も、移設作業や現場監督作業に研究代表者が従事・専念せねばならず、そのような期間が令和2年の2月まで続いたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
TPH2エクソン1, 2, 3 + イントロン1,2を300塩基程度含んだ断片およびATGを除いたルシフェラーゼをpCMV-Scriptに順次挿入して、EXON 2破断を検出するための一連のミニジーン(pCMV-Ex123-Luc)を得る。エクソン2については、前年度にpBluescriptにて作成した、STOPコドン変異のあるもの・ないものの2種類をそれぞれ挿入する。
スプライシング促進配列(exonic splicing enhancer; ESE)に結合する主な因子であるSF2/ASF、SC35、SRp40、SRp55の4種の結合配列も含め、オンラインツールESEfinder、RESCUE-ESE等を用いて結合可能性スコアの高い塩基配列に注目し、10か所程度をエクソン2のESE候補配列として選択する。これらに対するENA(ethylene-bridge nucleic acid)アンチセンスオリゴヌクレオチド(ENA-AO) (25～35塩基)を合成し、pCMV-Ex1-3-Lucと共にTPH2遺伝子を発現しないPC-12細胞へトランスフェクションする。ENA-AOによるスプライシング阻害が起きてEXON 2が破断されれば、EXON 2に人為的に挿入したストップコドンが除かれ、ルシフェラーゼが産生される。ルシフェラーゼアッセイにより、それぞれのENA-AO のEXON 2破断活性の有無を確認し、EXON 2破断活性の最も高いENA -AOを選別する。
一方、ホモロジー・モデリングでは立体構造が予測できなかったN末端側（wtTPH2の1－150残基部分、delTPH2の1－100残基部分）については、現在、Amber16を用いて分子動力学に基づく折りたたみの計算を行っている。次年度も、パラメーターを何通りか変えつつ、引き続き計算を行って、構造を予測する。
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| Causes of Carryover |
「７．現在までの進捗状況」に記載した通り、令和元年度に研究活動に従事できた期間がとても短かったため、予算の執行も半分程度となってしまった。遅れを取り戻すため、次年度に集中的に執行する予定。
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Research Products
(1 results)
