High-throughput verification of pathways regulating kidney diseases

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K22628
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 松阪 泰二 東海大学, 医学部, 教授 (50317749)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梅津 光央 東北大学, 工学研究科, 教授 (70333846)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2021-03-31
• Keywords: ポドサイト / 腎臓病 / 遺伝子改変 / 低分子抗体 / ガイドRNA

Outline of Annual Research Achievements

Cas9 knock-inマウスを、Nephrin-Creマウス、NEP25マウスと交配し、ポドサイト特異的にCas9とhCD25を発現するマウスを産出させた。東北大学梅津研究室において、hCD25に対する単鎖抗体に陽性荷電ペプチドを会合させた低分子抗体の開発が行われた。新型コロナウイルスのために、実験が長期間中断された事により、2020年末にようやく合成が完了した。hCD25発現細胞で検証したところ、担体タンパク質はhCD25に結合し、細胞内へ取り込まれた。また低分子抗体とRNAとの結合も確認した。しかしながら、担体タンパク質とRNAの複合体をhCD25発現細胞に添加しても、RNAの細胞内への取り込みは確認できなかった。
尿細管でCas9を発現させるマウスを作成するため、Cas9 knock-inマウスにSix2-CreERT2マウスを交配し、妊娠母マウスにtamoxyfenを投与した。目的のマウスを得るために、Tamoxyfen投与方法の試行錯誤と、帝王切開が必要であった。得られたマウスにRNAを送達させる試みを行った。陽性荷電した小分子タンパク質である、protamineとlysozymeをRNA 担体として用いる事を試みたが、尿細管へRNAを送達させる事はできなかった。腎盂から微細な針で注入し、electroporationをする方法を試みた。この方法でDextranは尿細管へ効率よく送達されたが、megalin sgRNAを投与しても、megalin遺伝子の変異は誘導できなかった。市販のlipofection試薬と複合させて静脈内投与したが、遺伝子変異の誘導は確認できなかった。