Immortalization of normal human neudoendocrine cells

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K22670
• Research Institution: National Cancer Center Japan
• Principal Investigator: 清野 透 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (10186356)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2022-03-31
• Keywords: 神経内分泌細胞 / 不死化 / ホルモン産生

Outline of Annual Research Achievements

PHLDA3遺伝子欠損神経内分泌腫瘍モデルマウスに形成される膵島腺腫、下垂体腺腫から変異CDK4, cyclin D1, BMI1の導入により細胞株の樹立に成功した。次いで、ヒト手術検体よりGHomaなどの下垂体腫瘍やCushing病、褐色細胞種の副腎腫瘍、Merkel細胞がん、由来不明の神経内分泌腫瘍の余剰検体より、初代培養を試みた。このうちMCpyV陽性のMerkel細胞がんとMCPyV陰性のMerkel細胞がんからは細胞株を樹立することに成功した。GHomaからも初期培養で間葉系細胞の中に上皮系細胞の形態をとる細胞が増殖した。CD56(NCAM)抗体磁気ビーズにより、CD56陽性細胞を繰り返し濃縮し、変異CDK4, cyclin D1, BMI1の導入によりGHoma由来と考えられる長期培養可能な上皮性細胞株を複数樹立できた。しかし、このうち2細胞株をRNAseqで解析した結果SynaptophysinやGHの発現は確認できず、本来のGHomaの性質を失った細胞株が樹立された。副腎腫瘍からはCushing病、褐色細胞種とも間葉系の細胞の増殖が主要細胞の増殖を凌駕し、腫瘍細胞株の樹立には至らなかった。
一方、膵頭部がんや乳頭部がんの正常膵臓組織部分より膵島細胞の培養と不死化を試みた。まずは、insulinプロモーターから発現するrtTA (tetOff)蛋白と、rtTAにより活性化するTREをもつpromoterから変異CDK4 (CDK4R24C), cyclin D1, TERTを発現するlentivirus vectorを導入することで、膵島由来と思われる小型の細胞の初期培養と長期維持に成功した。しかし、増殖が極めて遅く継代時にapoptosisの傾向が強く、安定した細胞株の樹立には至っていない。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ホルモン産生細胞の不死化には至っていないが、計画した培養条件を用いて神経内分泌腫瘍細胞の株化には成功しており計画は順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

大木操先生との共同研究によりPHLDA3遺伝子欠損神経内分泌腫瘍モデルマウスに形成される膵島腺腫、下垂体腺腫から変異CDK4, cyclin D1, BMI1の導入により細胞株の樹立に成功した。現在、不死化細胞の性状解析を進めており、ホルモン産生性がどれくらい維持されているかを調べる。ヒト由来の神経内分泌細胞についてはMerkel細胞がんがWnt/RSpoニッチを始め、各種増殖因子、阻害剤、核酸などを加えた培養条件下で、遺伝子導入することなく株化可能であることが示された。Merkel細胞がんではMCPyVのLT抗原の発現によるRbの不活化またはRbの変異により、変異CDK4, cyclin D1の導入が不要であったと考えられた。同培養条件下において、ヒト下垂体腺腫GHomaより神経内分泌細胞の初期培養と不死化には成功したが、ホルモン（GH）産生は確認できなかった。GH産生能が遺伝子導入あるいは不死化に至るどの段階で消失したかを調べ、解決策を模索する。GH産生細胞を特異的に不死化、維持するためにGH遺伝子promoterを用いた不死化遺伝子の発現システムの構築も試みる。TSHoma由来の細胞も同様に不死化できる感触を得ており、同様に株化を進める。しかし、副腎由来の腫瘍については上記培養条件においても、Cushing病、褐色細胞腫とも腫瘍細胞由来と思われる細胞の初期培養にすら成功していないため、一旦保留とし下垂体、膵島由来の細胞の不死化を優先する。膵島ベータ細胞については、上記培養条件で初期培養と長期維持は可能であることが分かったので、まずは細胞周期の誘導を優先するため一過性にHPV16 E6E7, MYC, RAS（以後EMRと略す）の4つのがん遺伝子セットをコンディショナルに発現させることでの実現を試みる。

Causes of Carryover

職場の移動に伴う移設準備のため3月中の実験を少し控えた。残額は4月以降の移設と研究室のセットアップの一部に充てる計画である。

Research Products

• [Journal Article] Efficient immortalization of human dental pulp stem cells with expression of cell cycle regulators with the intact chromosomal condition (2020)
  • Author(s): Orimoto, A. Kyakumoto, S. Eitsuka, T. Nakagawa, K. Kiyono, T. Fukuda, T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 15 Pages: e0229996
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0229996
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Primary and immortalized cell lines derived from the Amami rabbit (Pentalagus furnessi) and evolutionally conserved cell cycle control with CDK4 and Cyclin D1 (2020)
  • Author(s): Orimoto, A. Katayama, M. Tani, T. Ito, K. Eitsuka, T. Nakagawa, K. Inoue-Murayama, M. Onuma, M. Kiyono, T. Fukuda, T.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 525 Pages: 1046-1053
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.03.036
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Establishment of immortalized primary cell from the critically endangered Bonin flying fox (Pteropus pselaphon) (2020)
  • Author(s): Tani, T. Eitsuka, T. Katayama, M. Nagamine, T. Nakaya, Y. Suzuki, H. Kiyono, T. Nakagawa, K. Inoue-Murayama, M. Onuma, M. Fukuda, T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 14 Pages: e0221364
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0221364
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Uterine adenomyosis is an oligoclonal disorder associated with KRAS mutations (2019)
  • Author(s): Inoue, S. Hirota, Y. Ueno, T. Fukui, Y. Yoshida, E. Hayashi, T. Kojima, S. Takeyama, R. Hashimoto, T. Kiyono, T. Ikemura, M. Taguchi, A. Tanaka, T. Tanaka, Y. Sakata, S. Takeuchi, K. Muraoka, A. Osuka, S. Saito, T. Oda, K. Osuga, Y. Terao, Y. Kawazu, M. Mano, H.
  • Journal Title: Nat Commun Volume: 10 Pages: 5785
  • DOI: 10.1038/s41467-019-13708-y
  • Peer Reviewed