2019 Fiscal Year Research-status Report
A novel therapeutic strategy for ischemic stroke based on reshaping neuronal circuits in an activity-dependent manner
| Project/Area Number |
19K22687
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
坪井 昭夫 大阪大学, 生命機能研究科, 特任教授 (20163868)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 弘雄 香川大学, 医学部, 助教 (20390685)
森 英一朗 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (70803659)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
|
| Keywords | 神経科学 / 脳・神経 / 脳神経疾患 / 再生医学 / 神経可塑性 / 脳梗塞モデルマウス / ニューロン細胞死 / 神経保護 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
脳血管障害は、本邦の死因の４位となる発生頻度の高い疾患である。しかしながら、脳血管障害の多くを占める、脳梗塞により脳が大きく損傷した際に、失われたニューロンを補填するための効果的な治療法は確立されていない。また脳血管疾患は、認知症と並び、本邦で要介護者を生む最大の要因となっている。更に、脳梗塞に伴うニューロンの細胞死を防ぐことは、予後の脳機能の回復を促進するために、臨床医学上の重要な課題である。
脳梗塞モデルマウスやラットを用いた国内外の研究により、梗塞巣の大きさに影響を及ぼす複数の遺伝子が同定されている（Ageing Res Rev, 842, 2018）。これらの遺伝子は、脳梗塞から脳を守る役割を果たすと考えられる。しかしながら、多くの研究は、梗塞から２４時間以上経過して梗塞巣が形成された後、もしくは、そこからの回復過程に着目しているので、脳梗塞の発症直後のニューロンで生じる遺伝子発現の変動やその生理的な意義は、殆ど明らかにされていない。
申請者らは「脳梗塞の発症初期のニューロンにおいて、細胞死を防ぎ、生存を促す内在性のカニズムが、どのようにして作動するのか？」に着目し、以下の予備実験を行った。梗塞２時間後の脳梗塞モデルマウスを用いて、RNAシークエンシング解析により発現が変化する遺伝子を網羅的に探索した（未発表データ）。その結果、顕著に発現が変化する Npas4を含む27個の遺伝子を獲得した。そこで本研究においては、脳梗塞の発症初期に速やかに発現が誘導される転写因子Npas4に着目して、梗塞後にNpas4がニューロンの細胞死を抑制し、生存を促進するという「脳を守る内在性のメカニズム」を解明する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
脳梗塞による虚血時において、転写因子Npas4は神経細胞の生存に必須な因子であるが、転写因子をターゲットとした創薬はその作用点が多岐にわたる可能性が懸念された。そこで本研究では、脳梗塞モデルマウスに関してRNAシークエンシング解析を用いて、脳梗塞・再灌流の手術後に、梗塞巣の境界領域で発現が変化する遺伝子群の中から、Npas4の下流で働く遺伝子を探索した。その結果、30個の候補遺伝子が得られた、
その中から.マウス初代培養ニューロンに虚血様負荷をかけた際に生じる細胞死を指標にして、１つのNpas4下流分子の同定に成功した。これはRas-like small GTPaseファミリーに属し、この遺伝子を過剰発現させた初代培養ニューロンでは、虚血様負荷により生じる細胞死は顕著に減少し、逆に、この遺伝子を欠損させた場合には、細胞死が顕著に増加することが分かった。
そこで次に、このNpas4の下流遺伝子欠損マウスを作製して、令和2年3月までに、この分子に関する実験、実験結果の解析、研究成果のとりまとめを行う予定であった。しかしながら、このノックアウト（KO)マウスを作製する過程で、当初の想定に反して、ヘテロKOマウスの雄と雌同士を交配した際に、ホモKOマウスが生まれにくく、解析に必要な個体数を取得するのが困難であることが判明した。本研究遂行上、このホモKOマウスは不可欠であるので、作製を半年間延長して、本実験を実施する必要が生じた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１）脳梗塞に伴う異常な細胞内Ca2+流入に対するNpas4の役割：脳梗塞に伴う血流の低下は、ニューロンで膜電位の上昇を引き起こし、異常な細胞内へのCa2+流入が誘発される。虚血によるニューロンの異常な脱分極は広汎性脱分極と呼ばれ、虚血部位のみならず、周囲のニューロンに伝搬する。Npas4は、広汎性脱分極により発現が誘導されることが示唆されていたが、その役割は明らかにされていなかった。申請者らは最近、初代培養ニューロンにおいてNpas4遺伝子を過剰発現させると、虚血様負荷に伴う異常なCa2+流入が抑制され、細胞の生存が促進されることを見出した。そこで、初代培養ニューロンに関するCa2+イメージング解析や、Npas4欠損マウスを用いた解析により、脳梗塞に伴いニューロン間に伝搬する異常な細胞内へのCa2+流入、細胞死とNpas4の発現との関連性を明らかにする。
２）転写因子Npas4が発現制御する下流遺伝子の同定とその機能解析：①脳梗塞直後に、発現が増加する遺伝子を、RNAシークエンシングで解析する。②虚血様負荷後に、野生型由来の培養ニューロンで発現が増加し、Npas4欠損由来の培養ニューロンで発現が減少する遺伝子を、定量PCRで解析する。③培養ニューロンで予め遺伝子を過剰発現させた後に、虚血様負荷を与えて細胞死が減少する遺伝子を調べる。④同定された遺伝子の欠損マウスを作製し、中大脳動脈閉塞手術を行い、予後への影響を明らかにする。
３）Npas4やその下流遺伝子の過剰発現による脳梗塞に対する効果： アデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子導入・発現系を用いて、Npas4やその下流遺伝子をあらかじめ発現させたマウスに中大脳動脈閉塞手術を行い、予後への効果を明らかにする。
|
| Causes of Carryover |
Npas4の下流で働く遺伝子を、マウス初代培養ニューロンに虚血様負荷をかけた際に生じる細胞死を指標にして探索したところ、１つの候補分子を同定することに成功した。この分子はRas-like small GTPaseファミリーに属し、この遺伝子を過剰発現させた初代培養ニューロンでは、虚血様負荷により生じる細胞死は顕著に減少し、逆に、この遺伝子を欠損させた場合には、細胞死が顕著に増加することが分かった。
そこで次に、このNpas4の下流遺伝子の欠損マウスを作製して、令和2年3月までに、この分子に関する実験、実験結果の解析、研究成果のとりまとめを行う予定であった。しかしながら、このノックアウト（KO)マウスを作製する過程で、当初の想定に反して、ヘテロKOマウスの雄と雌同士を交配した際に、ホモKOマウスが生まれにくく、解析に必要な個体数を取得するのが困難であることが判明した。本研究遂行上、このホモKOマウスは不可欠であるので、作製を半年間延長して、本実験を実施する必要が生じた。
|
