2019 Fiscal Year Research-status Report

Investigation of new treatment strategy for the palatal scar tissue using RLN2 carried by the target-orientated liposomes.

Research Project

Project/Area Number	19K22703
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	森山啓司東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (20262206)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小川卓也東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (50401360) 東堀紀尚東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (50585221) 小林起穂東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (20596233)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2022-03-31
Keywords	リラキシン / 口蓋裂 / 瘢痕組織
Outline of Annual Research Achievements	RLN2は様々な生理作用を持つインスリン様ペプチドホルモンの一種で、恥骨結合や子宮周囲の線維性結合組織を弛緩させ分娩を補助することで広く知られている。近年ではその血管拡張作用と線維化抑制作用が急性心不全の治療薬としても注目されている。肝繊維腫のような病的線維化状態におけるリラキシン受容体１（RXFP１）の発現の上昇はすでに報告されている。また、RLN2がRXFP1/phospho-ERK/nNOS/NO/cGMP依存性の経路だけでなく、MMPの発現を促進するiNOSの発現も亢進するとされている。さらに筋線維芽細胞におけるiNOSの活性を阻害するTGF-β1リン酸化-Smad2の経路を抑制することで、RLN2はMMP産生の効果を示すiNOSを放出する。これらをふまえて、当分野での報告（Kamimoto H. et al., 2019）では、Cy5.5、酸化鉄をリポソームに内包させ、磁性制御によって口蓋粘膜にリポソームを集積させることが可能となった。ラット口蓋粘膜下にこのリポソームをマイクロインジェクション後、その局在をin vivo imaging観察し、48時間ごとにリポソームを追加注入することで組織内に一定のリポソームを局在させることが可能であることが明らかとなった。ラット上顎口蓋正中縫合の線維芽細胞におけるRXFP１の発現を確認した。また、ラットMPSの拡大中にリポソームをキャリアとしたRLN2がRXFP1を介して上顎正中口蓋縫合部の線維芽細胞におけるMmp-1、Mmp-2、Timp-1の発現を促進することを示した。これらのRLN2による細胞外基質代謝関連物質の発現上昇は、口蓋部に形成された瘢痕組織の分解作用を持つ可能性が考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ラット上顎口蓋正中縫合の線維芽細胞におけるRXFP１の発現を確認した。また、ラットMPSの拡大中にリポソームをキャリアとしたRLN2がRXFP1を介して上顎正中口蓋縫合部の線維芽細胞におけるMmp-1、Mmp-2、Timp-1の発現を促進することを示した。一方、2019年度内に着手する予定であった口蓋瘢痕組織特異的に存在する筋線維芽細胞および線維芽細胞の不死化とクローン化と、これら細胞の表現型に対するRLN2（RLN2-lipo）の作用をin vitroでの解析および生体親和性標的指向型リポソーム（糖鎖シアリルルイスＸ：SLX表面修飾）-RLN2の構築は未完遂であるため。
Strategy for Future Research Activity	1.RLN2-lipoの構築：リポソーム表面に炎症組織特異的集積を示す糖鎖SLXを修飾し、RLN2およびCy5.5を内包させる。 2.ラット株化筋線維芽細胞樹立およびモノクローナル化：4週齢雄性SDラット口蓋粘膜に3x5 mmの骨膜を含む粘膜欠損を形成し、瘢痕組織を形成する。これら瘢痕組織より、初代培養を経て、セルソーター（学内共有機器、FACS Aria II）にてαSMA陽性筋線維芽細胞および対照群としてαSMA陰性線維芽細胞を回収後、不死化細胞作製受託サービスにておのおの不死化細胞を得、限界希釈法によりクローン化（n=10）を行う。 3.RLN2-lipoが株化筋線維芽細胞特性に与える影響についての解析：各細胞にRLN2-lipoを作用させ、α-SMA、TGF-βタンパク質の発現量、Smad 2/3やJNKシグナル伝達関連因子のリン酸化の定量を行う。また、細胞増殖、アポトーシス、各種MMPs発現量、コラーゲン分泌量、コラーゲンゲル収縮率、細胞遊走率について解析する。
Causes of Carryover	本年度予定していたラット株化筋線維芽細胞樹立およびモノクローナル化の進捗状況が遅れたため次年度使用額が生じた。2020年度以降の動物実験に使用する予定である。