Investigation of new treatment strategy for the palatal scar tissue using RLN2 carried by the target-orientated liposomes.

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K22703
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 森山 啓司 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (20262206)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小川 卓也 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (50401360) ; 東堀 紀尚 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (50585221) ; 小林 起穂 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (20596233)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2022-03-31
• Keywords: リラキシン / 口蓋裂 / 瘢痕組織

Outline of Annual Research Achievements

RLN2は様々な生理作用を持つインスリン様ペプチドホルモンの一種で、恥骨結合や子宮周囲の線維性結合組織を弛緩させ分娩を補助することで広く知られている。近年ではその血管拡張作用と線維化抑制作用が急性心不全の治療薬としても注目されている。肝繊維腫のような病的線維化状態におけるリラキシン受容体1（RXFP1）の発現の上昇はすでに報告されている。腎臓の筋線維芽細胞においてRLN2シグナルはRXFP1を介してERK1/2のリン酸化やnNOS/NO/cGMP依存性の経路の活性化により伝達され、それにより筋線維芽細胞の分化と筋線維芽細胞の異所性コラーゲンの産生を仲介するSmad2のリン酸化やTGF-β1の活性を阻害するとされている。また、RLN2がRXFP1/phospho-ERK/nNOS/NO/cGMP依存性の経路だけでなく、MMPの発現を促進するiNOSの発現も亢進するとされている。さらに筋線維芽細胞におけるiNOSの活性を阻害するTGF-β1リン酸化-Smad2の経路を抑制することで、RLN2はMMP産生の効果を示すiNOSを放出する。これらをふまえて、当分野での報告（Kamimoto H. et al., 2019）では、ラット上顎口蓋正中縫合の線維芽細胞におけるRxfp１の発現を確認した。また、ラットMPSの拡大中にリポソームをキャリアとしたRLN2がRxfp1を介して上顎正中口蓋縫合部の線維芽細胞におけるMmp-1、Mmp-2、Timp-1の発現を促進することを示した。これら結果より、RLNは口腔内の間葉系組織における細胞外基質の代謝に影響を与え、TGF-β1リン酸化-Smad2の経路を抑制する可能性を強く示唆するものである。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2020年度内に着手する予定であった口蓋瘢痕組織特異的に存在する筋線維芽細胞および線維芽細胞の不死化とクローン化と、これら細胞の表現型に対するRLN2（RLN2-lipo）の作用をin vitroでの解析および生体親和性標的指向型リポソーム（糖鎖シアリルルイスＸ：SLX表面修飾）-RLN2の構築は未完遂であるため。

Strategy for Future Research Activity

1．RLN2-lipoの構築：リポソーム表面に炎症組織特異的集積を示す糖鎖SLXを修飾し、RLN2およびCy5.5を内包させる。
2．ラット株化筋線維芽細胞樹立およびモノクローナル化：4週齢雄性SDラット口蓋粘膜に3x5mmの骨膜を含む粘膜欠損を形成し、瘢痕組織を形成する。これら瘢痕組織より、初代培養を経て、セルソーター（学内共有機器、FACS Aria II）にてα-SMA陽性筋線維芽細胞および対照群としてα-SMA陰性線維芽細胞を回収後、不死化細胞作製受託サービスにておのおの不死化細胞を得、限界希釈法によりクローン化（n=10）を行う。
3．RLN2-lipoが株化筋線維芽細胞特性に与える影響についての解析：各細胞にRLN2-lipoを作用させ、α-SMA、TGF-βタンパク質の発現量、Smad 2/3やJNKシグナル伝達関連因子のリン酸化の定量を行う。また、細胞増殖、アポトーシス、各種MMPs発現量、コラーゲン分泌量、コラーゲンゲル収縮率、細胞遊走率について解析する。
4．RLN2-lipoがラット口蓋瘢痕組織の形成および顎成長に与える影響についての解析：上記方法でラット口蓋に瘢痕形成を行う（実験群：n=36、非処置群を対照群とする：n=36）と同時に、生理食塩水、liposome単独、またはRLN-lipo（10～1000 ng/kg）を48時間ごとに尾静脈より注入し、liposomeの集積状況をin vivo imagingにて確認する。1w, 3wで口蓋の切片を作成後、α-SMA免疫組織染色、マッソン染色やシリウスレッド染色で瘢痕組織料の定量化を行い、至適濃度を求める。また、9w（13週齢）まで1wごとにμCT撮影を行い、上顎骨の成長量や成長方向を比較する。

Causes of Carryover

2020年度内に着手する予定であった口蓋瘢痕組織特異的に存在する筋線維芽細胞および線維芽細胞の不死化とクローン化と、これら細胞の表現型に対するRLN2（RLN2-lipo）の作用をin vitroでの解析および生体親和性標的指向型リポソーム（糖鎖シアリルルイスＸ：SLX表面修飾）-RLN2の構築は受託サービスを利用する予定であったが、現在のところ進捗が遅延しており、受託サービス料金に計上していた研究費が次年度繰越となった。また、コロナ禍の影響で学術集会等がオンライン化し、旅費として計上していた額が次年度繰越となった。20201年度は上記受託サービス利用に加え、試薬等の消耗品、動物飼養料等に使用する予定である。