2021 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of new treatment strategy for the palatal scar tissue using RLN2 carried by the target-orientated liposomes.
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19K22703
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
森山 啓司 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (20262206)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小川 卓也 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (50401360)
東堀 紀尚 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (50585221)
小林 起穂 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (20596233)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2023-03-31
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| Keywords | リラキシン / 口蓋裂 / 瘢痕組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口蓋形成術後に生じる瘢痕組織は、生涯を通じて口蓋裂患者の顎顔面口腔領域の形態と機能に大きな影響を与える。現在口蓋瘢痕組織の根本的治療法はなく、克服すべき課題となっている。リラキシン (Relaxin, RLN) は主に周産期後期に子宮等より血中に分泌され、恥骨結合を弛緩させることが知られている。近年、RLNは強力なTGF-β-Smad2経路阻害作用を有することが明らかにされ、また抗線維化作用を持つことが明らかにされた。そこで本研究の目的を以下の3項目とした。①瘢痕組織特異的に存在する筋線維芽細胞および線維芽細胞の不死化とクローン化を行い、これら細胞の表現型に対するRLN2の作用をin vitroで解析する。②口蓋瘢痕形成モデルラットに生体親和性標的指向型リポソーム (糖鎖シアリルルイスX表面修飾) をDDSとしてRLN2を作用させ、瘢痕形成に対する作用を組織学的に検討する。③瘢痕形成モデルラットにおける上顎骨の成長発育様相に与えるRLN2-lipoの作用を三次元形態学的に検索する。2021年度は、以上の目的と合わせて、口蓋発生におけるヒストンメチル化酵素SETDB1の役割について検討した。神経堤細胞特異的Setb1欠失マウスを作成し、胎仔マウス口蓋における表現型解析、細胞増殖能について検討したところ、Setdb1は郊外の発生過程において細胞増直能およびPax9、Wnt5a、Fgf10の発現に影響を与えている可能性を示唆することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2021年度内に着手する予定であった口蓋瘢痕組織特異的に存在する筋線維芽細胞および線維芽細胞の不死化とクローン化と、これら細胞の表現型に対するRLN2（RLN2-lipo）の作用をin vitroでの解析および生体親和性標的指向型リポソーム（糖鎖シアリルルイスＸ：SLX表面修飾）-RLN2の構築は未完遂であったが、口蓋発生におけるヒストンメチル化酵素の役割を明らかにすることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1．ラット上顎口蓋正中縫合の線維芽細胞におけるリラキシン受容体1(Rxfp１)の発現、ならびにラット上顎口蓋正中縫合の拡大中におけるリポソームをキャリアとしたRLN2がRxfp1を介した上顎正中口蓋縫合部の線維芽細胞におけるMmp-1、Mmp-2、Timp-1の発現の促進など、本研究で得られた知見を、歯科領域にとどまらず、皮膚の瘢痕組織や臓器線維症の研究へとつなげる。
2．ラット株化筋線維芽細胞樹立およびモノクローナル化：4週齢雄性SDラット口蓋粘膜に3x5mmの骨膜を含む粘膜欠損を形成し、瘢痕組織を形成する。これら瘢痕組織より、初代培養を経て、セルソーター（学内共有機器、FACS Aria II）にてα-SMA陽性筋線維芽細胞および対照群としてα-SMA陰性線維芽細胞を回収後、 不死化細胞作製受託サービスにておのおの不死化細胞を得、限界希釈法によりクローン化（n=10）を行う。
3．RLN2-lipoが株化筋線維芽細胞特性に与える影響についての解析：各細胞にRLN2-lipoを作用させ、α-SMA、TGF-βタンパク質の発現量、Smad 2/3やJNKシグナ ル伝達関連因子のリン酸化の定量を行う。また、細胞増殖、アポトーシス、各種MMPs発現量、コラーゲン分泌量、コラーゲンゲル収縮率、細胞遊走率について解析する。
4．RLN2-lipoがラット口蓋瘢痕組織の形成および顎成長に与える影響についての解析：上記方法でラット口蓋に瘢痕形成を行う（実験群：n=36、非処置群を対照 群とする：n=36）と同時に、生理食塩水、liposome単独、またはRLN-lipo（10～1000 ng/kg）を48時間ごとに尾静脈より注入し、liposomeの集積状況をin vivo imagingにて確認する。1w, 3wで口蓋の切片を作成後、α-SMA免疫組織染色、マッソン染色やシリウスレッド染色で瘢痕組織料の定量化を行い、至適濃度を求め る。また、9w（13週齢）まで1wごとにμCT撮影を行い、上顎骨の成長量や成長方向を比較する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの感染拡大のため、研究打ち合わせならびに各種学会での成果発表がオンラインとなり、旅費の計上が必要ではなくなったため。
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Research Products
(12 results)
