2019 Fiscal Year Research-status Report
ナノ薄膜技術による3D歯根膜複合体の構築と新規細胞間相互作用解析システムの創出
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19K22711
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
竹立 匡秀 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (60452447)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北村 正博 大阪大学, 歯学研究科, 准教授 (10243247)
三木 康史 大阪大学, 歯学部附属病院, 助教 (10598395)
明石 満 大阪大学, 生命機能研究科, 特任教授(常勤) (20145460)
山口 佳則 大阪大学, 工学研究科, 招へい教授 (20386634)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| Keywords | 歯根膜組織 / 三次元培養 / Layer-by-Layer法 / 共培養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、ナノ薄層コーディング技術である交互積層法（Layer-by-Layer;LbL法）を歯科研究領域に取り入れ、歯根膜組織を生体類似の三次元立体組織として構築し、同組織内における細胞間相互作用を時空間で解析する実験モデルを確立することを目的に研究を遂行している。令和元年度は、ヒト歯根膜細胞（HPDL）単独、HPDLとヒト血管内皮細胞(HUVEC)、HPDLとヒトセメント芽細胞(HCEM)の組み合わせによる三次元組織をLbL法にて構築し、解析を進めている。HPDL単独でのLbL三次元組織では、組織構築24時間後において、歯根膜に特徴的な遺伝子であるPLAP-1やPOSTNの発現が、通常の二次元培養に比べ、有意に上昇することが明らかとなった。一方で、HPDL単独の場合、培養4日目以降で組織内に細胞死が認められ立体組織が経時的に菲薄化していくことが明らかとなった。そこで、HPDL（GFP標識）に対し1割にあたる細胞数のHUVECを混和し組織構築することにより、細胞死が抑制されるとともに、組織の厚みが4日目以降も維持されることが明らかとなった。また、抗CD31抗体を用いたwhole mountの免疫染色を行い、共焦点顕微鏡で観察したところ、組織構築3日目以降に立体組織内に血管管腔様の構造が観察された。この結果から、LbL法を用いた組織構築は、他のin vitroにおける立体組織構築手法と同様に、組織内部への培養液の流入が組織の維持に必要となることが示唆された。
さらに、HPDLとHCEMを、それぞれレンチウイルスを用いてGFP、TagBFPで蛍光標識し、LbL法を用いて三次元組織として重層させ、両細胞層の界面における細胞間相互作用について解析を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LbL法にて構築した三次元組織に対しラマン分光法を用いた解析を試みているものの、二次元培養に比べ、設定すべき条件が数多くあり、結果を得るに至っていない。しかしながら、他の共培養等の実験については一部前倒しで開始し、結果を得ているため研究全体の進捗状況としては順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度に構築した三次元歯根膜組織の三次元共焦点ラマンイメージング方による解析を進めるとともに、歯根膜細胞の硬組織形成細胞への分化過程に発現する分子群の可視化、および各種細胞間相互作用について解析を行う。
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| Causes of Carryover |
ある試薬の購入を予定していたが、納期が遅れたことで購入をキャンセルした。そのことで若干の繰越金が発生したものの、別試薬を用いた実験にて代替することができたため、研究の遂行に大きな問題は生じることはない。次年度使用額については、別試薬を購入するために執行し、研究結果の検証に活用する。
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