2022 Fiscal Year Annual Research Report
Development of bone anabolic drugs via evaluation of Wnt activity
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19K22728
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
中道 裕子 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 准教授 (20350829)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荒井 敦 松本歯科大学, 歯学部, 准教授 (00532772) [Withdrawn]
堀部 寛治 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (70733509)
宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801)
岩本 莉奈 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 助教 (20907216)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2023-03-31
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| Keywords | プロテオゲノミクス / Crispr-A / Wnt活性レポーター / 骨形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ゲノム編集技術を用いた遺伝子発現活性化（Crispr-A, Aは活性化activationの意味）または遺伝子発現ノックアウト（Crispr-KO）ライブラリーにより、活性化またはノックアウトされた遺伝子機能を、Wntシグナル活性依存性の薬剤感受性レポーターシステムで評価することで、骨形成制御因子を同定することを、目的とする。そのために、2019年～2021年度において、Wnt活性の上昇に応じて赤色蛍光色素の発光とともにゼオシン耐性を獲得するシステムと、Wnt活性の上昇に応じて緑色蛍光色素の発光とともにジフテリア毒素感受性を獲得するシステム の2種類を作製した。前者はBAR (beta-catenin activated reporter)-RedZeo、後者をBAR-DTR-GFPと命名した。両システムを導入するためのレンチウイルスベクターを作製し次いで、レンチウイルス感染によりレポーターシステムを導入したモノクローナルST2細胞とHEK293細胞モノクローン細胞を樹立した。また、Wnt3a処理したマウス骨髄間葉細胞株ST2細胞をリン酸化タンパク質量分析に供し、Wntシグナルによるタンパク質リン酸化の変化を解析した。5つのBiological replicateにおいて共通にシグナル強度が上昇するリン酸化ペプチドを得ることが出来た。そして、骨髄間葉系細胞の骨芽細胞分化および脂肪細胞分化過程の双方において、TGFbeta ファミリーのシグナルが大きく変動していることがわかった。これらのリン酸化が亢進したTGFbeta ファミリーのmRNA発現変化を解析した。最終年度には、WntレポーターマウスであるAxin2-tomatoマウスを用いた骨折治癒モデルにおいて、Wntの下流でこのTGFbataファミリーの分子が治癒促進に貢献していることを見出した。
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