New method to evaluate radiation effect by detecting structural variation

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K22913
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 吉浦 孝一郎 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 教授 (00304931)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2021-03-31
• Keywords: 不死化ヒト正常線維芽細胞 / 放射線 / DNA二本鎖切断 / 欠失 / 定量的測定 / ショートリード次世代シークエンサー / ロングリード次世代シークエンサー

Outline of Annual Research Achievements

本研究は，放射線照射を受けた細胞に発生するDNA二本鎖切断は，「修復されるもの」と「修復エラーで後世代に引き継がれるもの」に分けられる。このうち「後世代に引き継がれ残存する異常の実数測定」を目的とする。最終的には，１グレイ（Gy）当たり，１細胞当たり何個の異常が誘発され残存するのかの基盤情報を明らかにし，放射線被ばくによるゲノム異常量に基づくヒトへの放射線被ばく影響の指標化を目的とする。
BJ1-hTERT (BJ-5ta) 細胞は，human TERTによって不死化された安定正常線維芽細胞である。本細胞に0，1，3，6 Gyのγ線照射後に，選択培地なしに希釈培養することで細胞クローン化を実施した。各線量で10クローンずつ合計40クローンをpick up し，培養皿に直接SDS/ProteaseKを加えて細胞を溶解し，フェノール処理後にTE バッファーに対して透析することで，高分子DNAを抽出した。各クローンについて高分子DNA 120 ug 以上を抽出した。
2020年度は，このDNAを用いて，ショートリーソシークエンサー，ロングリードシークエンサー（Oxford Nanopore社）を使って，放射線照射によって惹起された欠失部位を網羅的に検出し，１グレイ（Gy）当たり，１細胞当たりの異常数を数値化する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

照射線照射後の細胞クローニングおよびDNA抽出まで順調に進んだ。
研究費の総額からして，40クローン全部を解析することは不可能であるが，充分量の細胞クローンを得ることができた。

Strategy for Future Research Activity

照射線照射後の細胞クローニングおよび高分子DNA抽出まで順調に進んだ。
2020年には，ショートリーソシークエンサー，ロングリードシークエンサー（Oxford Nanopore社），可能ならば SequelII（PacBio社）を使って，放射線照射によって惹起された欠失部位を網羅的に検出し，１グレイ（Gy）当たり，１細胞当たりの異常数を数値化する。
検出された全ての部位についてPCRによる確認を進めていく方針で，可能ならば 一塩基変異と小さな（< 5 bp）の欠失/挿入の確認も行い，３機器（ショートリーソシークエンサー，ロングリードシークエンサー（Oxford Nanopore社），SequelII（PacBio社））の検出の感度・特異度なども測定したい。

Causes of Carryover

本年度は，細胞クローン培養に力を注ぎ，ゲノム解析（ショートリード次世代シークエンサー，ロングリードシークエンサー（Oxford Nanopore社））には至らなかった。
多くの支出をともなうゲノム解析は，来年度に全て実行するため，次年度使用額が生じた。

Research Products

• [Journal Article] Target Capture/Next-Generation Sequencing for Nonsyndromic Cleft Lip and Palate in the Japanese Population. (2020)
  • Author(s): Shibano M, Watanabe A, Takano N, Mishima H, Kinoshita A, Yoshiura KI, Shibahara T.
  • Journal Title: The Cleft Palate-Craniofacial Journal Volume: 57(1) Pages: 80-87
  • DOI: 10.1177/1055665619857650
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] KAT6B-related disorder in a patient with a novel frameshift variant (c.3925dup). (2020)
  • Author(s): Hamaguchi Y, Aoki M, Watanabe S, Mishima H, Yoshiura KI, Moriuchi H, Dateki S.
  • Journal Title: Humane Genome Variation Volume: 64(4) Pages: 54
  • DOI: 10.1038/s41439-019-0085-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genome analysis of myelodysplastic syndromes among atomic bomb survivors in Nagasaki. (2020)
  • Author(s): Taguchi M, Mishima H, Shiozawa Y, Hayashida C, Kinoshita A, Nannya Y, Makishima H, Horai M, Matsuo M, Sato S, Itonaga H, Kato T, Taniguchi H, Imanishi D, Imaizumi Y, Hata T, Takenaka M, Moriuchi Y, Shiraishi Y, Miyano S, Ogawa S, Yoshiura KI, Miyazaki Y.
  • Journal Title: Haematologica Volume: 105(2) Pages: 358-365
  • DOI: 10.3324/haematol.2019.219386
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Possible mitochondrial dysfunction in a patient with deafness, dystonia, and cerebral hypomyelination (DDCH) due to BCAP31 Mutation. (2020)
  • Author(s): Shimizu K, Oba D, Nambu R, Tanaka M, Oguma E, Murayama K, Ohtake A, Yoshiura KI, Ohashi H.
  • Journal Title: Molecular Genetics and Genomic Medicine Volume: 17 Pages: e1129
  • DOI: 10.1002/mgg3.1129
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A homozygous splice site ROBO1 mutation in a patient with a novel syndrome with combined pituitary hormone deficiency. (2019)
  • Author(s): Dateki S, Watanabe S, Mishima H, Shirakawa T, Morikawa M, Kinoshita E, Yoshiura KI, Moriuchi H.
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 64(4) Pages: 341-346
  • DOI: 10.1038/s10038-019-0566-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of a homozygous frameshift variant in RFLNA in a patient with a typical phenotype of spondylocarpotarsal synostosis syndrome. (2019)
  • Author(s): Shimizu H, Watanabe S, Kinoshita A, Mishima H, Nishimura G, Moriuchi H, Yoshiura KI, Dateki S.
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 64(5) Pages: 467-471
  • DOI: 10.1038/s10038-019-0581-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nonsense mutation in CFAP43 causes normal-pressure hydrocephalus with ciliary abnormalities. (2019)
  • Author(s): Morimoto Y, Yoshida S, Kinoshita A, Satoh C, Mishima H, Yamaguchi N, Matsuda K, Sakaguchi M, Tanaka T, Komohara Y, Imamura A, Ozawa H, Nakashima M, Kurotaki N, Kishino T, Yoshiura KI, Ono S.
  • Journal Title: Neurology Volume: 92(20) Pages: e2364-e2374
  • DOI: 10.1212/WNL.0000000000007505
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of a novel CCDC22 mutation in a patient with severe Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis and aggressive natural killer cell leukemia. (2019)
  • Author(s): Yamashita Y, Nishikawa A, Iwahashi Y, Fujimoto M, Sasaki I, Mishima H, Kinoshita A, Hemmi H, Kanazawa N, Ohshima K, Imadome KI, Murata SI, Yoshiura KI, Kaisho T, Sonoki T, Tamura S.
  • Journal Title: International of Hematology Volume: 109(6) Pages: 744-750
  • DOI: 10.1007/s12185-019-02595-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of a variant-associated with early-onset diabetes in the intron of INS gene with exome sequencing. (2019)
  • Author(s): Matsuno S, Furuta H, Kosaka K, Doi A, Yorifuji T, Fukuda T, Senmaru T, Uraki S, Matutani N, Furuta M, Mishima H, Iwakura H, Nishi M, Yoshiura K, Fukui M, Akamizu T.
  • Journal Title: Journal of Diabetes Investigation Volume: 10(4) Pages: 947-950
  • DOI: 10.1111/jdi.12974
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Evaluation of Face2Gene using facial images of patients with congenital dysmorphic syndromes recruited in Japan. (2019)
  • Author(s): Mishima H, Suzuki H, Doi M, Miyazaki M, Watanabe S, Matsumoto T, Morifuji K, Moriuchi H, Yoshiura KI, Kondoh T, Kosaki K.
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 64(8) Pages: 789-794
  • DOI: 10.1038/s10038-019-0619-z
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cystic biliary atresia with paucity of bile ducts and gene mutation in KDM6A: a case report. (2019)
  • Author(s): Masui D, Fukahori S, Mizuochi T, Watanabe Y, Fukui K, Ishii S, Saikusa N, Hashizume N, Higashidate N, Sakamoto S, Takato A, Yoshiura KI, Tanaka Y, Yagi M.
  • Journal Title: Surgical Case Reports Volume: 5(1) Pages: 132
  • DOI: 10.1186/s40792-019-0688-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TERT mRNA Expression as a Novel Prognostic Marker in Papillary Thyroid Carcinomas. (2019)
  • Author(s): Tanaka A, Matsuse M, Saenko V, Nakao T, Yamanouchi K, Sakimura C, Yano H, Nishihara E, Hirokawa M, Suzuki K, Miyauchi A, Eguchi S, Yoshiura KI, Yamashita S, Nagayasu T, Mitsutake N.
  • Journal Title: Thyroid Volume: 29(8) Pages: 1105-1114
  • DOI: 10.1089/thy.2018.0695
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Atypical phenotype without fever in a Japanese family with an autosomal dominant transmission of familial Mediterranean fever due to heterozygous MEFV Thr577Asn mutations. (2019)
  • Author(s): Endo Y, Koga T, Nakashima M, Mishima H, Yoshiura KI, Kawakami A.
  • Journal Title: Clinical and Experimental Rheumatology Volume: 37 Suppl 121(6) Pages: 161-162
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 重度の成長障害，精神運動発達遅滞を認めたOgden症候群の女児例． (2020)
  • Author(s): 川野奈々江，福島直喜，吉浦孝一郎，井原健二．
  • Organizer: 第42回小児遺伝学会学術集会 （コロナウイルス禍により開催中止）
• [Presentation] A case of CREBBP exon 31 de novo missense mutation presented with insomnia and intellectual disability without Rubinstein-Taybi syndrome phonotype. (2020)
  • Author(s): Yoriko Watanabe, Kaori Fukui K, Koichiro Yoshiura, Yushiro Yamashita.
  • Organizer: 2020 American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) Annual Clinical Genetics Meeting （コロナウイルス禍により開催中止）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒト正常圧水頭症の原因遺伝子 (2019)
  • Author(s): 吉浦 孝一郎，森本芳郎，吉田真太朗，菰原義弘，松田勝也，中島正洋，三嶋博之，木下晃，小野慎治．
  • Organizer: 第4回 放射線災害・医科学研究拠点カンファランス
• [Presentation] Genome Sequence for diagnosis and successive research of genetic disorders． (2019)
  • Author(s): 吉浦孝一郎
  • Organizer: The 13th World Congress of The International Cleft Lip and Palate Foundation，第59回 日本先天異常学会学術集会
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 当院のIRUD の実績と遺伝カウンセリングの実際． (2019)
  • Author(s): 高尾真未，宮田海香子，松本 正，三嶋博之，三浦清徳，吉浦孝一郎．
  • Organizer: 第26回 出生前から小児期にわたるゲノム医療フォーラム
  • Invited
• [Presentation] IRUDによって原因遺伝子が確定した家族の出生前検査に対する思い． (2019)
  • Author(s): 宮田海香子，松本 正，高尾真未，三嶋博之，三浦清徳，吉浦孝一郎．
  • Organizer: 第26回 出生前から小児期にわたるゲノム医療フォーラム
  • Invited
• [Presentation] 周産期領域における遺伝カウンセリング． (2019)
  • Author(s): 長谷川ゆり，宮田海香子，三浦生子，吉浦孝一郎，三浦清徳．
  • Organizer: 第64回 日本人類遺伝学会
  • Invited
• [Presentation] 乳がん患者における血漿遊離DNA (cfDNA) 濃度と血漿循環腫瘍DNA (ctDNA) の解析． (2019)
  • Author(s): 及川将弘，瀬戸口優美香，榎本康子，久松和史，濱田哲夫，大坪竜太，松本 恵，矢野 洋，永安 武，三嶋博之，木下 晃，吉浦孝一郎．
  • Organizer: 第64回 日本人類遺伝学会
• [Presentation] 次世代シーケンサーを用いた日本全域の家族性地中海熱患者におけるMEFV遺伝子の包括的解析． (2019)
  • Author(s): 古賀智裕，三嶋博之，宮田海香子，三浦清徳，吉浦孝一郎，川上 純．
  • Organizer: 第64回 日本人類遺伝学会
• [Presentation] LARP7遺伝子複合ヘテロ接合体変異によるAlazami症候群の２症例． (2019)
  • Author(s): 伊達木澄人，里 龍晴，渡辺 聡，宮田海香子，近藤達郎，松本 正，吉浦孝一郎，森内浩幸．
  • Organizer: 第64回 日本人類遺伝学会
• [Presentation] 本邦における先天性形態以上症候群患者の顔貌画像を用い他診断補助システムFace2Geneの評価． (2019)
  • Author(s): 三嶋博之，鈴木寿人，近藤達郎，吉浦孝一郎，小崎健次郎．
  • Organizer: 第64回 日本人類遺伝学会
• [Book] 遺伝医学への招待（改訂第6版） (2020)
  • Author(s): （監修）新川詔夫、（著者）太田 亨，吉浦孝一郎，三宅紀子
  • Total Pages: 196
  • Publisher: 南江堂
  • ISBN: 978-4-524-24931-2