2020 Fiscal Year Research-status Report
A construction of new biosensor technology enabling highly sensitive detection of alpha-synuclein fibril originated from Parkinson's disease patient
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19K22964
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
野田 実 京都工芸繊維大学, 電気電子工学系, 教授 (20294168)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山門 穂高 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (10378771)
島内 寿徳 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (10335383)
寒川 雅之 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (70403128)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | パーキンソン病 / αシヌクレイン / リポソーム / 脂質膜 / カンチレバーセンサ / フィブリル / オリゴマー / モノマー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者が研究、開発してきたリポソーム固定化カンチレバーセンサ技術とRT-QuIC法という異常凝集タンパク質(aSyn)増幅技術を組み合わせて、aSyn凝集体の特異的かつ超高感度な検出の可能性を探索することを目的とする。臨床医学での現使用技術では感度自体、特に再現性の点で能力不足で実用レベル技術は現在無い。本年度は以下の進展が得られた。
まずaSynのカンチレバーセンサ検出原理面では、前年度確認された「aSyn微量フィブリルのモノマーへの自己鋳型化現象」に伴うと考えられる格段の高感度化の結果から、本年度は同結果の検証として、カンチレバー固定化リポソーム上での現象を可視認識すべく液中AFM観察を行い、センサ検出時濃度よりかなり高濃度化ではあるが同上でのaSynの凝集動態の一端を確認した。そして別センシング技術であるが測定原理が類似した力学センサであるQCMを用いて同現象を評価した結果、それらの濃度依存性、現象の経時特性が同一の傾向を有することを確認できた。
次に特異的検出感度向上を図るためにリポソーム表面糖脂質C16,C18修飾で検出感度増大が前年度確認されたが、タンパク質とリポソームの相互作用に対する糖脂質C16とC18の効果を検証した結果、それらの濃度依存性から母体の脂質との相分離が原因であると示唆された。
さらにデバイス技術では、チップ上のレイアウト性及び歩留まり改善のため、本年度高感度を維持しつつカンチレバー構造体のサイズ縮小を図った。歪検知用NiCr薄膜の作製条件の再検討と応力集中により、カンチレバー長が1/3程度でも以前の10倍以上の感度を確保できることを実証した。
そして今後本技術との比較する上で具体的データベースとなる従来手法のELISA、RT-QuICによるパーキンソン病患者等の生体サンプルでの評価系を構成した。それら評価データの収集を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度「aSyn微量フィブリルのモノマーへの自己鋳型化現象」に伴うと考えるカンチレバーセンサ上での格段の感度向上が確認されたため、カンチレバー上での同現象を可視化すべく液中AFM観察を行い、センサ検出時濃度よりかなり高濃度化であるが同上でのaSynの凝集動態の一端を確認した。そして別センシング技術であるが測定原理が類似した力学センサであるQCMを用い、同現象を評価した結果、濃度依存性、現象の経時特性の観点で同一の傾向を確認できた。現報告時点では使用したQCMよりも作製・使用中のカンチレバーセンサが1桁程度高感度であった。
前年度糖脂質C16, C18修飾で検出感度増大を確認し、糖脂質の相分離を示唆したが、さらにタンパク質とリポソームとの相互作用に対する脂質C16, C18の濃度依存性を検討した結果、単調増加ではなく、一定の濃度で相互作用の強度が大きく増大した。これは母体の脂質との相分離が原因であることをさらに示唆した。
カンチレバーの感度改善では、前年度同構造体の応力を集中させることで20倍の感度向上を達成したが、同面積が大きくなり、センサチップ上レイアウト自由度や作製歩留まりの面で課題があった。そこで感度のカンチレバーサイズ依存性を理論面、実験面双方から検討した結果、その長さを単に短くすると感度は低下するが、従来と同程度(昨年度の1/3程度の長さ)のサイズであっても、新設計のカンチレバーでは10倍以上の感度が確保できた。また歪ゲージに用いるNiCr薄膜成膜時の基板温度の高温化で感度向上することを確認した。
そして今後根拠とする生体サンプル中の超微量aSyn凝集体を測定するための系として、ELISAとRT-QuICの系を確立した。PBSバッファー中の精製aSyn凝集体の測定においては、ELISAにおいてはpg/mlオーダーのaSyn oligomerが検出可能であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の進捗にて、本研究の主要目的であるaSyn凝集体の超高感度検出の技術的実現性がより具体化されてきた。前年度「aSyn微量フィブリルのモノマーへの自己鋳型化現象」をカンチレバーセンサ上で良好に発現できたと考えられたが、液中ＡＦＭでの可視的なaSynフィブリルの凝集動態の一端を確認、そして別センシング技術のＱＣＭにて同等のaSyn濃度依存性、経時特性を再確認できた。前年度からの開発中の新技術である糖脂質C16,C18修飾では、さらにその濃度依存性からある一定濃度が必要で母体脂質からの相分離現象が明らかとなり、確認されていた検出高感度化の原因が具体的になってきた。また同じく開発中新技術であるカンチレバーセンサデバイス技術として歪ゲージNiCr薄膜では、発生ノイズ低減のために製膜温度の最適化が有用であるとともに、微量窒素や酸素の添加も有用である可能性が見えてきた。
今後最終年度に向けて、効果が検証されたaSynの自己鋳型化現象を発現させるバイオプロトコルと、開発する新技術である糖脂質C16,C18修飾と歪ゲージNiCr薄膜の製膜プロセス技術の融合により、aSyn極微量フィブリルの特異的検出を具体的に実現していく。
一方、データベース構築、蓄積の点で、臨床医学側からのパーキンソン病患者、患者予備軍の方々から生体液、主に髄液を測定、評価中である。上記ELISAとRT-QuICの系は精製凝集aSynに対して有効であったが、生体サンプル中には抗原抗体反応・RT-QuIC反応を阻害する様々な物質が存在するため、抗凝集aSyn抗体を用いた精製過程を挿入し、感度・特異度の向上を目指す。これら従来技術の具体的な能力、問題点をさらに明白にしていく。
以上、今後の実験、評価結果を基に、挑戦的研究(萌芽)の本質的な成果の獲得として進めていく。
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| Causes of Carryover |
１）２０２０．９－１１月、２０１２，３月の学会発表旅費、学生含め計３名の使用予定、２）２０２０，４月－２０２１，２月での学外機関での測定装置使用費の使用予定、ならびに３）購入予定消耗品の消耗品費の使用予定が、新型コロナウィルス禍のために使用不可能になってしまったため。
研究自体は順調に成果が出てきており、次年度には上記装置使用ならびに購入が遅れた消耗品の購入を進め、全体計画が遅滞ないように研究作業内容を進める。
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[Journal Article] α-Synuclein Spread from Olfactory Bulb Causes Hyposmia, Anxiety, and Memory Loss in BAC-SNCA Mice2021
Author(s)
Uemura N, Ueda J, Yoshihara T, Ikuno M, Uemura MT, Yamakado H, Asano M, Trojanowski JQ, Takahashi R
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Journal Title
Mov Disord. 2021 Feb 6. doi: 10.1002/mds.28512. Epub ahead of print. PMID: 33547846
Volume: 2
Pages: 28512
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Mice with cleavage-resistant N-cadherin exhibit synapse anomaly in the hippocampus and outperformance in spatial learning tasks2021
Author(s)
Asada-Utsugi M, Uemura K, Kubota M, Noda Y, Tashiro Y, Uemura TM, Yamakado H, Urushitani M, Takahashi R, Hattori S, Miyakawa T, Ageta-Ishihara N, Kobayashi K, Kinoshita M, Kinoshita A
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Journal Title
Mol Brain. 2021 Jan 25;14(1):23. doi: 10.1186/s13041-021-00738-1. PMID: 33494786; PMCID: PMC7831172.
Volume: 14
Pages: 23.
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] BCAS1-positive immature oligodendrocytes are affected by the α-synuclein-induced pathology of multiple system atrophy2020
Author(s)
Kaji S, Maki T, Ueda J, Ishimoto T, Inoue Y, Yasuda K, Sawamura M, Hikawa R, Ayaki T, Yamakado H, Takahashi R
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Journal Title
Acta Neuropathol Commun. 2020 Jul 29;8(1):120. doi: 10.1186/s40478-020-00997-4. PMID: 32727582; PMCID: PMC7391509
Volume: 8
Pages: 120
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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