2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of non-viral vector to realize treatment of hereditary disease using genome editing RNA technology
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19K22972
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| Research Institution | Daiichi University, College of Pharmaceutical Sciences |
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Principal Investigator |
有馬 英俊 第一薬科大学, 薬学部, 教授 (50260964)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
城野 博史 熊本大学, 病院, 准教授 (40515483)
北岸 宏亮 同志社大学, 理工学部, 教授 (60448090)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / デンドリマー / シクロデキストリン / 結合体 / mRNA / ３元複合体 / 肝臓ターゲティング / トランスサイレチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者らのオリジナルの非ウイルスベクターであるポリアミドアミン (PAMAM) デンドリマー/シクロデキストリン結合体（CDE）に肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドを結合体したGN-PaCを用いたゲノム編集に基づく難治性遺伝子疾患治療に関する検討を実施している。本研究の特徴は、細胞における外来遺伝子の発現に大きなバリアとなっている細胞核膜を突破が不要なCRISPR mRNAとガイドRNAとGN-PaCとの３元複合体を用いて、肝臓の難治性疾患であるトランスサイレチン（TTR）型家族性アミロイドポリニューロパチー（TTR-FAP）に対するゲノム編集に基づく根治治療を目的としている。2022年度は次のような検討を行った。レポーター遺伝子として、Cap1構造を有するルシフェラーゼmRNAはCap0構造を有するmRNAに比べて遺伝子発現効率が高いことが示された。ジェネレーション (G) が異なるPAMAMデンドリマーとmRNAとの複合体形成を電気泳動により確認した結果、G2はN/P比1.0以上で、G3とG4はN/P比0.5以上で完全に複合体を形成し、GN-PaC(G3)もmRNAと完全に複合体を形成した。N/P比100で形成したPAMAMデンドリマー(G3)/mRNA複合体は、正のゼータ電位を示し、粒子径は約1000 nmであった。一方、GN-PaC(G3)複合体はPAMAMデンドリマー(G3)複合体と同様なゼータ電位を示すとともに、サブミクロンのサイズの微粒子を形成した。N/P比100で形成したPAMAMデンドリマー(G3)/mRNA複合体は、PAMAMデンドリマー(G2)複合体及びPAMAMデンドリマー(G4)複合体よりもHepG2細胞及びHeLa細胞において、高い遺伝子発現を示した。さらに、GN-PaC(G3)/mRNA複合体は、希釈溶媒としてOpti-MEMを用いることにより、PAMAMデンドリマー(G3)/mRNA複合体よりも高い遺伝子発現を示した。研究業績に関しては論文発表及び学会発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
2022年度も新型コロナウイルス感染拡大防止対策などが影響し、研究の進捗は遅れる結果となった。当初、（１）CRISPR mRNA及びガイドRNAの構築、（２）肝実質細胞特異的mRNAキャリアとしてのGN-PaCの開発、（３）これら複合体の調製と物理化学的性質の評価、（４）ヒト肝実質培養細胞（HepG2細胞）でのゲノム編集効率に関する基礎的検討、（５）実験動物におけるGN-PaC(G3)/mRNA複合体を静脈内投与後の体内動態、安全性、有効性について検討を行う予定であったが、（２）、（３）及び（４）についての検討は実施できたが、３元複合体の調製及び（５）に関して検討が未実施となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度も研究の進捗の遅れを挽回できなかったため、研究期間を延長して次の検討を行う予定である。（１）CRISPR TTR mRNA/ガイドRNA/GN-PaCから成る３元複合体を用いた各種肝実質細胞におけるゲノム編集効率・細胞障害性に関する検討、（２）健常マウス及びFAP トランスジェニックモデルマウスにおけるCRISPR mRNAおよびガイドRNAの体内動態、ゲノム編集効果及び安全性に関する検討である。これらの検討を行うことにより、当初の目標である申請者らが開発した肝実質細胞特異的非ウイルスベクターを用いた肝臓の遺伝子疾患（難病）であるTTR-FAPに対する根治療法としてのin vivoゲノム編集技術の開発を進めたい。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染拡大防止の対策等により研究の進捗が遅れたため
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[Journal Article] Feasibility Study of Dendrimer-Based TTR-CRISPR pDNA Polyplex for Ocular Amyloidosis in Vitro2022
Author(s)
Masamichi Inoue, Kyosuke Muta, Ahmed Fouad Abdelwahab Mohammed, Risako Onodera, Taishi Higashi, Kenta Ouchi, Mitsuharu Ueda, Yukio Ando, Hidetoshi Arima, Hirofumi Jono, Keiichi Motoyama
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Journal Title
Biol Pharm Bull
Volume: 45
Pages: 1660-1668
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Multifunctional Therapeutic Cyclodextrin-Appended Dendrimer Complex for Treatment of Systemic and Localized Amyloidosis2022
Author(s)
Masamichi Inoue, Taishi Higashi, Yuya Hayashi, Risako Onodera, Kazuya Fujisawa, Toru Taharabaru, Ryoma Yokoyama, Kenta Ouchi, Yohei Misumi, Mitsuharu Ueda, Yasuteru Inoue, Mineyuki Mizuguchi , Takashi Saito, Takaomi C Saido, Yukio Ando, Hidetoshi Arima, Keiichi Motoyama, Hirofumi Jono
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Journal Title
ACS Appl Mater Interfaces
Volume: 14
Pages: 40599-40611
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Fine-tuned cholesterol solubilizer, mono-6-O-α-D-maltosyl-γ-cyclodextrin, ameliorates experimental Niemann-Pick disease type C without hearing loss2022
Author(s)
Yusei Yamada, Toru Miwa, Masaki Nakashima, Aina Shirakawa, Akira Ishii, Nanami Namba, Yuki Kondo, Toru Takeo, Naomi Nakagata, Keiichi Motoyama, Taishi Higashi, Hidetoshi Arima, Yoichi Ishitsuka et al.
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Journal Title
Biomed Pharmacother
Volume: 155
Pages: 113698
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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