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2019 Fiscal Year Research-status Report

Application of hyperactive antifreeze from a cold-tolerant insect

Research Project

Project/Area Number 19K22989
Research InstitutionNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology

Principal Investigator

津田 栄  国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 上級主任研究員 (70211381)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 大山 恭史  国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80356675)
近藤 英昌  国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80357045)
Project Period (FY) 2019-06-28 – 2022-03-31
Keywords不凍タンパク質 / オオクワガタ / チャイロコメノゴミムシダマシ / 熱ヒステリシス / ナノ氷結晶 / 再結晶化阻害剤 / 遺伝子 / アミノ酸
Outline of Annual Research Achievements

分子生物学や生化学の手法を駆使することによって、オオクワガタ(Dorcus hopei binodulosus)終齢幼虫の組織液が含んでいる強力な凝固点降下能をもつ物質、すなわち不凍物質を単離精製することに成功した。解析の結果、この物質はタンパク質であることが判明し「オオクワガタ由来不凍タンパク質(DcbAFP)」と名付けた。更なる解析を進め、1匹のオオクワガタの幼虫が6種類の不凍タンパク質アイソフォーム(DcbAFP1~6)を混合物として体内に発現していることを突き止めた。そこで、組織液に含まれている遺伝子の配列解析を行い、DcbAFP1~6をコードするDNAを特定した。DcbAFP1~6の骨格構造は、TCTxSxNCxxAx(T:スレオニン、C:システイン、S:セリン、N:アスパラギン、x:任意のアミノ酸)で表される12残基のアミノ酸配列が6~8回繰り返したもので出来ており、それらの分子量は8.2~11.2kDaの範囲にあると考えられた。このようにして、オオクワガタがもつ強力な不凍物質の素性を解明することができたが、この先の応用実験に向けて同物質を大量精製する上で、オオクワガタ幼虫が非常に高価であることが問題になった。そこで、オオクワガタと同じ不凍タンパク質をもつ別の昆虫を探索したところ、チャイロコメノゴミムシダマシ(Tenebrio molitor)が利用できることが判明した。この昆虫の幼虫はミルワームと呼ばれ、小鳥など小動物のエサとして大量生産する手法が確立されている。そこで上述の実験プロトコルをミルワームに適用し、その不凍タンパク質(TmAFP1~12)のアミノ酸と遺伝子の配列を決定することに成功した。今後はDcbAFPとTmAFPの両方を用いて研究を進める。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度の研究目標は、オオクワガタ(Dorcus hopei binodulosus)終齢幼虫がもつ強力な不凍物質がどのようなものかを明らかにすることであった。本研究により、これが不凍タンパク質(Antifreeze Protein)であること、しかもそれが僅かにアミノ酸成分が異なる6種類の不凍タンパク質アイソフォームの混合物(DcbAFP1~6)であることが明らかになった。さらに、これらのタンパク質をコードするDNAを組織液の中から抽出し、それらの配列決定にも成功した。こうして、DcbAFP1~6が、12残基のアミノ酸配列のタンデム・リピートであることを見出した。その結果、遺伝子工学的手法によるDcbAFP1~6の人工合成が可能になった。しかし、人工合成で得られるタンパク質量は10~20mgであり、ナノ氷結晶作製実験には量が足りないことが問題になった。大量に幼虫を購入して組織液を集め、そこからタンパク質を大量抽出すれば良いが、オオクワガタは非常に高価である。そこで、オオクワガタと同じ不凍タンパク質をもつ別の昆虫を探索し、チャイロコメノゴミムシダマシ(Tenebrio molitor)が利用できることを突き止めた。この昆虫の幼虫すなわちミルワームは小動物のエサとして安価に大量に入手可能である。研究を進め、安価なミルワーム不凍タンパク質(TmAFP1~12)が高価なオオクワガタ不凍タンパク質の代用品として使えることを明らかできた。今後の研究にDcbAFPとTmAFPの両方を利用できる状況に至っており、本研究は順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

次年度の研究目標は、応用実験に向けたオオクワガタ由来不凍タンパク質(DcbAFP1~6)又はその同等品であるミルワーム由来不凍タンパク質(TmAFP1~12)の大量精製法を確立し、それらの熱安定性、水溶性、熱ヒステリシス活性、氷結晶成長抑制機能、氷結晶形状制御能などを明らかにし、ナノ氷結晶作製に向けた基礎的知見を得ることである。そのために、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、冷却ステージ付き顕微鏡システムなどを用いた生化学・物理化学的実験を進める。水の凍結過程を詳細に観察するための分光学実験も並行して行う。氷結晶の成長抑制にはタンパク質表面に結合している水分子の数と構造が重要であり、それらが実験の度に変化するようだと結果が安定しないと考えられる。特にこの点に注意してAFPサンプルの精密な作製手順を確立したい。

Causes of Carryover

オオクワガタ由来不凍物質がタンパク質であることが早い段階で判明し、すでにあるクロマトグラフィー・ベースの不凍タンパク質大量精製システムを活用できることになった。これにより氷晶プローブを用いた精製システムが省略可能になり、支出の抑制に繋がった。2020年初頭に新型コロナウィルス感染症が社会問題化し、共同研究者との打ち合わせや学会・研究集会への参加が全て取りやめになった。また実験に関わる備品や消耗品の調達請求もできなくなった。2020年度内に緊急事態宣言が解除され研究再開が可能になれば、ガラス・消耗品等の購入や研究集会への参加費用を支出させて頂きたいと考えております。

  • Research Products

    (27 results)

All 2020 2019 Other

All Journal Article (6 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 6 results,  Open Access: 5 results) Presentation (19 results) (of which Int'l Joint Research: 10 results,  Invited: 2 results) Remarks (2 results)

  • [Journal Article] Fish-Derived Antifreeze Proteins and Antifreeze Glycoprotein Exhibit a Different Ice-Binding Property with Increasing Concentration2020

    • Author(s)
      Tsuda Sakae、Yamauchi Akari、Khan N. M.-Mofiz Uddin、Arai Tatsuya、Mahatabuddin Sheikh、Miura Ai、Kondo Hidemasa
    • Journal Title

      Biomolecules

      Volume: 10 Pages: 423~423

    • DOI

      10.3390/biom10030423

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Freeze Tolerance in Sculpins (Pisces; Cottoidea) Inhabiting North Pacific and Arctic Oceans: Antifreeze Activity and Gene Sequences of the Antifreeze Protein2019

    • Author(s)
      Yamazaki Aya、Nishimiya Yoshiyuki、Tsuda Sakae、Togashi Koji、Munehara Hiroyuki
    • Journal Title

      Biomolecules

      Volume: 9 Pages: 139~139

    • DOI

      https://doi.org/10.3390/biom9040139

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Calcium-Binding Generates the Semi-Clathrate Waters on a Type II Antifreeze Protein to Adsorb onto an Ice Crystal Surface2019

    • Author(s)
      Arai Tatsuya、Nishimiya Yoshiyuki、Ohyama Yasushi、Kondo Hidemasa、Tsuda Sakae
    • Journal Title

      Biomolecules

      Volume: 9 Pages: 162~162

    • DOI

      https://doi.org/10.3390/biom9050162

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Expression of Ice-Binding Proteins in Caenorhabditis elegans Improves the Survival Rate upon Cold Shock and during Freezing2019

    • Author(s)
      Kuramochi Masahiro、Takanashi Chiaki、Yamauchi Akari、Doi Motomichi、Mio Kazuhiro、Tsuda Sakae、Sasaki Yuji C.
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 9 Pages: 6246~6246

    • DOI

      https://doi.org/10.1038/s41598-019-42650-8

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Presence of a basic secretory protein in xylem sap and shoots of poplar in winter and its physicochemical activities against winter environmental conditions2019

    • Author(s)
      Tsutomu Aohara, Jun Furukawa, Kenji Miura, Sakae Tsuda, Jessica S. Poisson, Robert N. Ben, Peter W. Wilson & Shinobu Satoh
    • Journal Title

      Journal of Plant Research

      Volume: 132 Pages: 655-665

    • DOI

      https://doi.org/10.1007/s10265-019-01123-9

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] 線虫C.エレガンスを用いた不凍タンパク質のin vivo解析2019

    • Author(s)
      倉持昌弘、高梨千晶、山内彩加林、戸井基道、三尾和弘、津田 栄、佐々木裕次
    • Journal Title

      Cryobiology and Cryotechnology

      Volume: 65 Pages: 23~26

    • DOI

      https://doi.org/10.20585/cryobolcryotechnol.65.1_23

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 魚類および微生物由来不凍タンパク質の比較による細胞保護メカニズムの解明2019

    • Author(s)
      山内彩加林、新井達也、室井宏仁、三浦 愛、近藤英昌、津田 栄
    • Organizer
      第64回低温生物工学会
  • [Presentation] 不凍タンパク質の ice affinity とその氷結晶への吸着機構について2019

    • Author(s)
      宮脇長人、津田 栄、萩原知明、鈴木 徹
    • Organizer
      第64回低温生物工学会
  • [Presentation] ICE RECRYSTALLIZATION IS EFFICIENTLY TERMINATED BY ANTIFREEZE PROTEIN-BINDING TO MULTIPLE ICE PLANES2019

    • Author(s)
      津田 栄
    • Organizer
      2019年度国際低温生物学会(CRYO2019)
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Practical Use of New Quality Products of Antifreeze Protein2019

    • Author(s)
      津田 栄、三浦 愛、近藤英昌
    • Organizer
      2019年度国際分析化学会(AnalytiX-2019)
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] In vivo effect of Ice-Binding Protein Cold tolerance observation and X-ray single molecular measurement using living C. elegans2019

    • Author(s)
      倉持昌弘、董 芸格、高梨千晶、山内彩加林、戸井基道、青山 光輝、関口 博史、三尾和弘、津田 栄、佐々木裕次
    • Organizer
      第19回日本蛋白質科学会年会
  • [Presentation] Ice-Binding Proteins Improves the Survival Rate of Caenorhabditis elegans at Non-freezing Temperature2019

    • Author(s)
      倉持昌弘、董 芸格、高梨千晶、戸井基道、青山 光輝、関口 博史、三尾和弘、津田 栄、佐々木裕次
    • Organizer
      第57回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] The in vivo effects of the ice-binding protein mutations for the cold tolerance in C. elegans2019

    • Author(s)
      倉持昌弘、董 芸格、高梨千晶、戸井基道、三尾和弘、津田 栄、佐々木裕次
    • Organizer
      第42回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] Dynamics And Functions of Antifreeze Proteins In Transgenic Caenorhabditis Elegans At Freezing Environments2019

    • Author(s)
      倉持昌弘、董 芸格、高梨千晶、戸井基道、三尾和弘、津田 栄、関口 博史、佐々木裕次
    • Organizer
      米国化学会(ASCB-EMBO2019)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Sequence Determination and Characterization of Type I AFPs from Liposetta pinnifasciata (Barfin Plaice)2019

    • Author(s)
      渡辺 爽、Sheikh mahatabuddin、三浦 愛、近藤英昌、津田 栄
    • Organizer
      第7回国際生命科学シンポジウム
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Lifetime of cell line is dramatically improved by electroporator-assisted permeation of antifreeze protein2019

    • Author(s)
      金子雅規、室井宏仁、山内彩加林、三浦 愛、近藤英昌、津田 栄
    • Organizer
      第7回国際生命科学シンポジウム
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Development of an efficient production method of recombinant antifreeze proteins2019

    • Author(s)
      田中博基、津田 栄、近藤英昌
    • Organizer
      第7回国際生命科学シンポジウム
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ギスカジカ由来不凍タンパク質の構造と機能の解析2019

    • Author(s)
      宮川祥英、三浦 愛、近藤英昌、津田 栄
    • Organizer
      2019極限環境生物学会年会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] エレクトロポレーションによる不凍タンパク質の細胞内導入がもたらす生存率改善効果2019

    • Author(s)
      金子雅規、室井宏仁、山内彩加林、三浦 愛、近藤英昌、津田 栄
    • Organizer
      2019極限環境生物学会年会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] トウガレイ由来I型不凍タンパク質の構造機能解析2019

    • Author(s)
      渡辺 爽、Sheikh mahatabuddin、三浦 愛、近藤英昌、津田 栄
    • Organizer
      2019極限環境生物学会年会
  • [Presentation] ウシ体外発生培地への不凍タンパク質添加が胚発生および発育に及ぼす影響2019

    • Author(s)
      瀧上結葵、津田 栄、西寒水 将、今井 敬、堂地 修
    • Organizer
      2019年度北海道人工授精技術研究会
  • [Presentation] 不凍タンパク質の界面前進凍結濃縮における ice affinityについて2019

    • Author(s)
      宮脇長人、津田 栄、萩原知明、鈴木 徹
    • Organizer
      日本食品科学工学会第66回大会
  • [Presentation] 時分割回折X線法による線虫C.エレガンスの不凍タンパク質と氷の1分子動態観察2019

    • Author(s)
      董 芸格、倉持昌弘、高梨千晶、三尾和弘、戸井基道、青山光輝、関口 博史、津田 栄、佐々木裕次
    • Organizer
      第33回日本放射光学会年会・放射光科学合同シンポジウム
  • [Presentation] THE OBSERVATION OF THE ICE-BINDING PROTEIN FOR FREEZING AND COLD TOLERANCE OF TRANSGENIC CAENORHABDITIS ELEGANS2019

    • Author(s)
      倉持昌弘、戸井基道、三尾和弘、津田 栄、佐々木裕次
    • Organizer
      The Biophysical Society 64th Annual Meeting USA
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] SINGLE MOLECULAR OBSERVATION OF AFP AND ICE-CRYSTAL DYNAMICS IN CAENORHABDITIS ELEGANS BY TIME-RESOLVED X-RAY DIFFRACTION MEASUREMENTS2019

    • Author(s)
      董 芸格、倉持昌弘、高梨千晶、三尾和弘、戸井基道、関口 博史、津田 栄、佐々木裕次
    • Organizer
      The Biophysical Society 64th Annual Meeting USA
    • Int'l Joint Research
  • [Remarks] プレスリリース・低温環境に弱い線虫が氷点下で生き延びた!

    • URL

      https://www.aist.go.jp/aist_j/press_release/pr2019/pr20190515/pr20190515.html

  • [Remarks] 津田 栄 ホームページ

    • URL

      https://staff.aist.go.jp/s.tsuda/index.html

URL: 

Published: 2022-12-28  

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