2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K23790
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| Research Institution | Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
水藤 拓人 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 特別協力研究員 (80847723)
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| Project Period (FY) |
2019-08-30 – 2021-03-31
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| Keywords | ショウジョウバエ / 脂質 / 感覚神経 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では感覚受容の分子機構の解明を目指し、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）において、温度や機械刺激を受容する感覚神経細胞を対象とした脂質制御遺伝子の網羅的な発現解析と脂質制御遺伝子の感覚応答に与える影響の解析を計画している。
本年度は、ショウジョウバエ３齢幼虫からの感覚神経細胞の単離手法の確立に取り組んだ。GAL4-UASシステムによって感覚神経特異的にエピトープタグタンパク質を発現させ、抗体結合磁気ビーズを用いて、感覚神経の一つであるdendritic arborization neuronを単離し、既知の感覚制御に関与する脂質制御遺伝子の発現解析を行ったところPhospholipase Cの発現が高いことを見出した。本発現解析結果は感覚神経の単離によって初めて示されたものであり、また感覚神経において特異的に脂質制御遺伝子が発現し、機能していることを示すものであると考えている。さらに本結果は、他の脂質制御遺伝子についても発現解析から機能的な連関の可能性を示唆できることを示すものであると考えている。今後、確立した単離手法を用いて様々な末梢感覚神経の単離とRNAseqを用いたトランスクリプトーム解析を用いて網羅的に感覚神経細胞に発現する脂質制御遺伝子の解析を実施する。
また、本年度はショウジョウバエ３齢幼虫の行動解析スクリーニング手法の開発に取り組んだ。温度勾配装置上での個体の移動速度や方向転換行動を解析するためのショウジョウバエ個体行動追跡手法の確立を目指した。光依存的な行動を抑えるため暗箱中で赤色光を光源とした環境において、動画を撮影し、取得した動画から多個体の行動を同時に追跡する手法を確立した。本手法はトランスクリプトーム解析から同定した候補遺伝子のスクリーニングにおいて利用する計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度はショウジョウバエ３齢幼虫からの感覚神経の単離手法の確立とトランスクリプトーム解析の実施までを計画していた。
当初、感覚神経の感覚神経細胞の単離方法として先行論文を参考にした手法の適応を計画していたが、当該手法を用いた細胞単離手法では標的外細胞のコンタミネーションが顕著に見られたため、抜本的な手法の改良に取り組んだ。
現在までに先の先行文献以外でのショウジョウバエ感覚神経細胞の単離の実例は報告されていなかったため、新規にショウジョウバエ３齢幼虫から細胞を単離する手法について検討を開始し、酵素を使用した細胞分散方法および使用するビーズ等試薬を検討した。このように、磁気結合抗体ビーズを用いた感覚神経細胞の単離手法の確立に時間を要したため、当初計画から遅れることとなった。
しかしながら、先行してトランスクリプトーム解析方法の検討やスクリーニング手法の開発に着手しており、トランスクリプトーム解析後の実験の遂行は順当に実施できると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は確立した神経単離手法を用いて、ショウジョウバエ３齢幼虫から複数種類の末梢感覚神経細胞を単離し、それぞれのトランスクリプトーム解析をRNAseqにより実施する。発現が確認された脂質の合成や代謝機能持つと推定される遺伝子の中から感覚神経以外の細胞と比較して特定の感覚神経細胞群で発現が高い等、特徴的な発現パターンを示す100個程度の遺伝子を、感覚受容機能に重要な脂質制御遺伝子の候補とする。RNA干渉法を用いてこれらの候補遺伝子を感覚受容ニューロン特異的にノックダウンし、ショウジョウバエ3齢幼虫個体での侵害的温度に対する忌避行動、温度勾配装置上での体温調節行動、機械刺激応答に関する行動を指標としてスクリーニングを実施し、感覚受容に重要な脂質制御遺伝子の候補を探索する。また、候補遺伝子のノックアウト個体を作成する。
候補遺伝子の感覚受容ニューロンにおける機能的役割を探索するため、脂質制御遺伝子を機能阻害した個体における感覚受容ニューロンの温度や機械刺激に対する応答をCa2+プローブを用いたin vivoイメージングによって観察する。また、脂質制御遺伝子自身の脂質合成・代謝機能を明らかにするため、脂質制御遺伝子を機能阻害した個体から感覚受容ニューロンを単離し、質量分析装置などを用いて遊離脂肪酸やリン脂質などの脂質組成の変化を観察する。さらに、脂質制御遺伝子をクローニングし、in vitroでの酵素学的な機能解析や、ショウジョウバエ培養細胞で脂質制御遺伝子を過剰発現あるいは発現抑制した際の脂質組成の変化を観察する。そして、ショウジョウバエの培養細胞にTRPチャネルなどの感覚受容体を発現させ、脂質制御遺伝子の強制発現や発現抑制などによって感覚受容体の活性が変化するのか、イメージングや電気生理学的手法を用いて明らかにする。
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| Causes of Carryover |
研究計画の遅延に伴い本年度に実施予定であった、RNAseqの受託解析費用を次年度に繰り越す。RNAseq解析は次年度早々に実施する計画である。
また、本年度末に参加予定の学会が中止になったため旅費の計上がなくなった。次年度は学会に参加する計画である。
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