retriever複合体の機能不全が新規の先天異常症候群を生じるメカニズムの解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K23823
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 加藤 耕治 名古屋大学, 環境医学研究所, 特任助教 (40844056)
• Project Period (FY): 2019-08-30 – 2021-03-31
• Keywords: レトリーバー複合体 / エンドソーム / Prx1-Cre / Nestin-Cre

Outline of Annual Research Achievements

我々は頭蓋顔面、小脳、骨格系などの形成異常を呈した兄弟例から、新規の疾患原因遺伝子としてVPS35Lを同定した。VPS35Lの個体発生における役割を検討するためにVps35l欠失マウス（KOマウス）を作成したが、KOマウスは胎生早期に致死であったことを受け、Vps35l-floxマウスを樹立した。このfloxマウスを用いて、患者で明確な表現型がみられた骨格系の検討を行うためにPrx1-Cre、Col2a1-Creマウスと交配して、骨格系特異的Vps35l欠失マウス（S-cKO）を樹立した。また、神経系の発生における役割を検討するため、Nestin-Creマウスと交配し、神経系特異的KOマウス(N-cKO)を樹立した。
Prx1-Creマウスを用いたS-cKOマウスは、コントロールのマウスに比較して小柄であり、患者と同様に指が短い傾向があった。また、骨格標本を作製したところ、頭蓋骨の骨化遅延を含めた。これらの結果から、VPS35Lは骨形成に必須であり、その欠損により骨形成異常を呈することが示唆された。現在MC3T3E1やATDC5のセルラインでのノックダウンに加えて、s-cKOマウス由来の骨芽細胞、軟骨細胞の培養準備を進めており、これらの細胞を用いてVps35lが骨形成に果たす役割を検討していく。
Nestin-Creマウスを用いたN-cKOマウスでは、著名な成長障害、てんかん、過敏性を認め、半分以上が生後2-3週にかけて死亡することが分かった。組織学的な検討では、同腹コントロールに比して明確な変化を認めており、これらの表現型の背景に存在する分子メカニズムを検討していく予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していた通り、Vps35l-floxマウスを樹立し、以下のcKOマウス系統を樹立した。また、その分子メカニズムを検討するための細胞培養系も樹立した。
(1)Vps35l-floxマウスとPrx1-Creマウスを用いて、S-cKOマウスを樹立し、成長障害の評価、骨格標本の作成やCTの撮影などを用いて、個体表現型の評価は順調に進んでいる。これらの個体数を増やすことにより、個体間に有意な差があることを示すことが出来ると考えている。また、更なる個体を用いたRNAやタンパクレベルの解析に使用できると考えている。
(2)MC3T3E1やATDC5などの骨芽細胞、軟骨芽細胞を用いてVps35lをノックダウンした上で骨誘導試薬を添加することにより、Vps35lの骨形成における役割を評価する実験系を樹立した。この実験系を用いて、更なるメカニズムの解明に取り組んでいきたい。
(3)Vps35l-floxマウスとNestin-Creマウスを用いて、N-cKOマウスを樹立し、成長障害の評価、行動の評価、病理学的評価を開始しているところであり、個体数を確保して病態解明につなげていけると考えている。

Strategy for Future Research Activity

前年度に引き続き、以下の3項目を実施していく。
(1)S-cKOマウスに関しては、Prx1-Creマウスの表現型解析を進めて行く。現在P0での骨格標本を評価しているが、発生期における相違を確認するため、胎児期の個体の解析も行っていく予定である。また、胎児期の個体からRNAを採取することにより、その背景に存在するメカニズムの解明を行っていきたい。Prx1-Creに加えてCol2a1-Creとの交配も進めて行く。これにより、Vps35lが働いている時期が間葉系幹細胞からの分化段階であるのか、もしくはそれ以降の骨芽細胞や軟骨芽細胞などのLineageに分かれてからなのかを判断することが出来ると考えている。
(2)in vitroの培養系では、骨形成に重要なBMP-2やTGF-βなどへの反応性を検討していきたいと考えている。Vps35lの機能不全は骨化不全を呈することは分かってきているので、これによりその更なる背景を明らかにする。
(3)N-cKOマウスにおいては、前年度に引き続き個体表現型を病理組織学的に検討していく。加えて、個体からRNAを採取して、その遺伝子発現変化を解析することで、特に小脳形成異常の原因を探っていく。また、小脳顆粒前駆細胞のprimary cultureも用いて、Vps35l欠損が脳形成異常を引き起こすメカニズムを検討する。

Causes of Carryover

予定していた細胞系の実験が、COVID-19の影響で一部だけ実施できない部分があり、その実験に使用予定であった試薬を購入しなかったため。

Research Products

• [Presentation] Biallelic VPS35L pathogenic variants cause 3C/Ritscher-Schinzel-like syndrome through dysfunction of retriever complex (2019)
  • Author(s): Kato K, Oka Y, Muramatsu H, Vasilev F, Otomo T, Oishi H, Kawano Y, Nakazawa Y, Ogi T, Takahashi Y, Saitoh S.
  • Organizer: ASHG 2019 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] VPS35Lの両アレルにおける機能喪失型バリアントは 3C/Ritscher-Schinzel 症候群に類似の先天異 常症候群の原因となる (2019)
  • Author(s): 加藤耕治, 岡泰由, 村松秀城, Vasilev F, 大友孝信, 大石久史, 河野好彦, 中沢由華, 荻朋男, 高橋義行, 齋藤伸治.
  • Organizer: 日本人類遺伝学会第64回大会