胸腺退縮に伴うT細胞ミトコンドリア障害のメカニズムと機能的意義の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K23862
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 城 憲秀 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (50849552)
• Project Period (FY): 2019-08-30 – 2023-03-31
• Keywords: T細胞 / ミトコンドリア / 胸腺退縮 / 恒常性増殖 / 生体外物質トランスポーター

Outline of Annual Research Achievements

申請者らは、胸腺摘出マウス(ATx)のT細胞においてミトコンドリア膜電位プローブの染色性が低下しているという予備的結果をもとに、「胸腺退縮に伴う恒常性増殖が、ミトコンドリア機能障害を介してT細胞老化に影響する」という仮説を立てて、本研究を開始した。
令和2年度までに、細胞外フラックスアナライザー等のミトコンドリア膜電位プローブ以外の方法を用いてATx T細胞におけるミトコンドリア機能に関する評価を行ったが、いずれのアッセイにおいてもミトコンドリア機能低下を示唆する結果は認められなかった。網羅的遺伝子発現解析から候補因子を探索する中で、MDR1（Multiple drug resistance 1）遺伝子がATxのT細胞で高発現していることが判明し、ミトコンドリア膜電位プローブを細胞外に排出している可能性が示唆された。実際にMDR1阻害剤でATxのT細胞を処理すると、ミトコンドリア膜電位プローブの染色性低下がキャンセルされた。以上の結果は、当初の仮説を否定することとなったが、一方ではＴ細胞老化におけるMDR1の重要性を新たに示唆した。
令和2年度にはMDR1 KOマウス作製に成功し、T細胞老化におけるMDR1の生物学的意義を明らかにする計画であった。しかし、COVID-19パンデミックにより、同年7月より制限は解除されたが、出勤制限などの影響もあり、実験再開に時間を要した。
令和3年度にはMDR1 KOマウスでミトコンドリア膜電位プローブの染色性が強いこと確認し、プローブがMDR1の基質であることを証明した。現在、MDR1 KOマウスに胸腺摘出術、高脂肪食などの負荷を与えて、T細胞維持におけるMDR1の役割を解析している。またIn vitroでMDR1 KOマウス由来のT細胞に様々な基質を添加して培養し、生存や活性化に与える影響を検証している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

申請者らは当初、胸腺摘出マウス(ATx)のT細胞においてミトコンドリア膜電位プローブの染色性が低下しているという予備的結果をもとに、「胸腺退縮に伴う恒常性増殖が、ミトコンドリア機能障害を介してT細胞老化に影響する」という仮説を立てて、本研究を開始した。
しかし、別記のような実験結果から、ATxのT細胞ではミトコンドリア膜電位の低下は無く、細胞膜上に存在して細胞毒性を有する化合物などを細胞外排出するMDR1による可能性が示唆された。したがって、研究仮説の変更を行い、MDR1 KOマウスの作成を行うところから研究を再スタートさせることとなった。また、COVID-19パンデミックにより、同年7月より制限は解除されたが、出勤制限などの影響もあり、実験再開に時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

MDR1 KOマウスの胸腺や末梢リンパ組織を、フローサイトメトリーを用いて解析し、T細胞の分化・成熟に明らかな異常を認めなかった。作製されたマウスは全身性のKOマウスを有しているが、発育・成長にも大きな異常を認めず、今後のT細胞におけるMDR1の機能的解析に使用することが問題ないと考えられた。現在は、交配ではなく体外受精によるコロニー拡大を行うことで、研究進捗を促進させるように努めている。
今後は、若齢期に胸腺摘出をしたMDR1 KOマウスもしくは高齢MDR1 KOマウスのT細胞の状態を解析することで、胸腺摘出に伴うT 細胞の恒常性増殖や自然加齢におけるMDR1の機能的意義について検証を行う。CD3陽性細胞数、CD4/8比を定量し、MDR1の末梢組織でのT細胞長期生存に寄与する役割を評価する。また、BrdU投与やKi-67染色を行い、恒常性増殖の程度を評価する。MDR1が長期生存に寄与する場合には、毒性のある生体外物質を細胞外に排出している可能性がある。原因物質として代謝産物もしくは蛋白物質を考える場合にはメタボローム解析やプロテオミクス解析などを検討する。またMDR1は脂質を生体外に排出する機能を有することが報告されている。上記マウスに高脂肪食やウェスタンダイエットなどのストレスを与えて、生活習慣病がT細胞の維持に与える影響及びMDR1の役割について検証する。またIn vitroでMDR1 KOマウス由来のT細胞に様々な基質を添加して培養し、生存や活性化に与える影響を検証している。

Causes of Carryover

別記のような実験結果から、ミトコンドリア機能障害という当初の仮説は否定され、新たにMDR1という分子に着目するに至った。研究仮説の変更を行い、MDR1 KOマウスの作成を行うところから研究を再スタートさせることとなった。また、COVID-19パンデミックにより、同年7月より制限は解除されたが、出勤制限などの影響もあり、実験再開に時間を要した。