Analysis of the role of UBD-dependent intracellular protein regulation in the pathogenesis of inflammatory bowel disease.

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K23990
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 河本 亜美 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 特任助教 (70849124)
• Project Period (FY): 2019-08-30 – 2021-03-31
• Keywords: ヒト腸上皮 / TNF-α / UBD

Outline of Annual Research Achievements

本年度は当初研究計画に従い「ヒト腸上皮内UBD依存的UBL-PSM系標的分子の網羅的探索・同定」について研究を実施した。具体的にはNotch活性化とTNF-α刺激を誘導する事により「UBD依存的UBL-PSM系」を活性化する複数の条件下で細胞内蛋白を回収し、質量分析を用いた網羅的解析(iTRAQ法)等により、UBD存在下・非存在下で発現量が変化する標的蛋白の同定を試みた。その結果、以下の様な成果を得ている。
1)iTRAQ法によりNotch活性化とTNF-α共刺激を加えた際に培養したヒト腸上皮オルガノイドについて、発現量が50%以上低下し得る遺伝子群として62種の蛋白を同定した。この内、蛋白量の減少が最も著しいと予想された3種の蛋白 (AGR2, SOX9, Annexin A1)についてWestern Blot法で解析したところ、有意なタンパク量の変化は再現されなかった。
2)一方、免疫沈降法によりUBDと結合する蛋白について解析を試みたところ、オートファジー等におけるアダプター蛋白であるｐ62蛋白と結合することが示された。しかしながら、UBDの高発現誘導やUBD欠損細胞株におけるNotch活性化とTNF-α共刺激により蛋白発現量の変化がみられなかったことから、UBDの標的蛋白とは異なる未知の役割があるものと考えられた。3)Flagタグ付きUBD発現株と野生型細胞株においてNotch活性化とTNF-α共刺激下における蛋白発現量の変化をFLAGタグ免疫沈降後の銀染色ゲル等で解析したところ、少なくとも4種のバンド(40kD, 45kDa, 48kD, 62kD)に量的増加が認められ、UBDの新規標的分子候補と考えられたため、質量分析による蛋白同定解析を実施する方針とした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初計画におけるiTRAQ解析やFlagタグ付きUBD発現系による分子間結合能を有する分子の探索・同定は概ね終了していることから、当初計画に沿って概ね順調に進捗していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

本年度計画は概ね順調に推移していることから、当初計画に沿い、次年度以降は上記にて得られたUBD標的蛋白候補について、質量分析等による同定とUBD発現下における蛋白分解応答に関する解析を進め、オルガノイド等を用いた表現型解析を行う計画である。

Causes of Carryover

・次年度使用額が生じた理由：試薬等が計画当初より廉価で購入可能であった為。
・使用計画：検討する数・種類を拡大して解析を行う為、試薬を増量して購入する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Organoid-based regenerative medicine for inflammatory bowel disease. (2020)
  • Author(s): Ryuichi Okamoto, Hiromichi Shimizu, Kohei Suzuki, Ami Kawamoto, Junichi Takahashi, Mao Kawai, Sayaka Nagata, Yui Hiraguri, Sayaka Takeoka, Hady Yuki Sugihara, Shiro Yui, Mamoru Watanabe
  • Journal Title: Regen Ther Volume: 13 Pages: 1-6
  • DOI: 10.1016/j.reth.2019.11.004
  • Open Access