癌進展に関わる乳癌患者腸内細菌叢と宿主微小環境構築の交互作用解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K24057
• Research Institution: Fukuoka Dental College
• Principal Investigator: 和田 寛也 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 臨床教授 (70851509)
• Project Period (FY): 2019-08-30 – 2021-03-31
• Keywords: メタゲノム解析 / 乳癌 / 腸内細菌叢 / 次世代シーケンサー

Outline of Annual Research Achievements

腸管免疫は腸内細菌叢と量的・質的にバランスを保っており、dysbiosisと呼ばれる腸内細菌叢の恒常性の変容は、炎症性腸疾患などの消化管疾患のみならず、消化管外が標的となる関節リウマチや多発性硬化症などの全身性自己免疫疾患の発症に影響を及ぼすと考えられている。更に、近年、メタゲノム解析が可能となり、健常人由来の糞便のマイクロバイオームプロフィールや、疾患発症・進展並びにそれに関する宿主の免疫環境との関連性が徐々に明らかになっている。現在の所、腸内細菌叢が実際の癌患者、特に乳癌などの非消化器癌の発癌・進展、腫瘍内微小環境並びに宿主の癌免疫応答へ及ぼす影響はほとんど明らかとなっていない。本研究では、健常人との比較によって、乳癌患者特徴的な腸内細菌叢のプロフィールを同定し、それらの菌群の乳癌進展に及ぼす影響を検討する。また、TCGAデーターベースをリファレンスとして利用し、Nanostring技術によって同定された免疫サブタイプ（腫瘍内微小環境）と同定された腸内細菌叢との関連性を解析し、腫瘍免疫療法の奏効性に強く関わる免疫関連サブタイプ（腫瘍内微小環境）並びに乳癌患者の宿主免疫環境に与える影響を明らかにし、その分子機序を標的とする革新的がん治療薬開発の契機を得る。
現在、被験者のリクルート中であり、MiSeqシステムを用いた複数サンプル解析用のIndexが付与されたライブラリーの作製準備中である。まずは24サンプルのリクルート（術前後のため、症例数は12例以下）を目標に、可及的速やかに収集し、収集完了次第、シーケンス解析及び臨床データー解析を施行予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

16S Metagenomic Sequencing Library作製は、糞便よりDNAを抽出し、16S V3-V4領域（本研究）に対し、特異的プライマーを用いたPCRで増幅後、最大12　ｘ　8　＝　96サンプルの検体にインデックスアダプターを付加し、シーケンスライブラリーを作製、同時にMiSeqシステムでシーケンス配列を読み取り解析する。そのため、1ランのシーケンス時には、解析する多検体を入手しておく必要がある。現在、被験者のリクルート段階で、少なくとも24検体入手した後にシーケンスを施行する予定である。そのため、検体収集に時間を要し、腸内細菌叢の解析開始に時間がかかっている。

Strategy for Future Research Activity

今後以下の研究を施行する：
①健常人及び乳癌患者の糞便のメタゲノム解析健常人及び乳癌患者の糞便を採取し、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析を施行し、乳癌患者に特徴的に見られる細菌群を同定する。
②乳癌のサブタイプ解析と臨床病理学的事項の腸内細菌叢の関連性を検討する。
③末梢血単核球及び腫瘍内炎症細胞のサブタイプ解析と腸内細菌叢の関連性を検討する。
④乳癌組織の免疫微小環境のサブタイプ化と腸内細菌叢の関連性を検討する。

Causes of Carryover

16S Metagenomic Sequencingは、最大96サンプルを同時にシーケンスすることでコストを下げることができる。現在は被験者のリクルートの段階で、DNA抽出用の消耗品及び抽出したDNAのQuality checkにかかる費用を主として計上している。従って、今後購入されるシーケンス試薬にかかる費用を次年度使用に繰り越す必要が生じた。今後、まずは24検体を入手した後に16S Metagenomic Sequencingを施行し、前述の研究計画を速やかに遂行する。