癌進展に関わる乳癌患者腸内細菌叢と宿主微小環境構築の交互作用解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K24057
• Research Institution: Fukuoka Dental College
• Principal Investigator: 和田 寛也 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 臨床教授 (70851509)
• Project Period (FY): 2019-08-30 – 2022-03-31
• Keywords: メタゲノム解析 / 乳癌 / 腸内細菌叢 / 次世代シーケンサー

Outline of Annual Research Achievements

現在、腸内細菌叢が実際の癌患者、特に乳癌などの非消化器癌の発癌・進展、腫瘍内微小環境並びに宿主の癌免疫応答へ及ぼす影響はほとんど明らかとなってい ない。本研究では、健常人との比較によって、乳癌患者特徴的な腸内細菌叢のプロフィールを同定し、それらの菌群の乳癌進展に及ぼす影響を検討する。また、 TCGAデーターベースをリファレンスとして利用し、Nanostring技術によって同定された免疫サブタイプ(腫瘍内微小環境)と同定された腸内細菌叢との関連性を 解析し、腫瘍免疫療法の奏効性に強く関わる免疫関連サブタイプ(腫瘍内微小環境)並びに乳癌患者の宿主免疫環境に与える影響を明らかにし、その分子機序を 標的とする革新的がん治療薬開発の契機を得る。
・福岡歯科大学の乳癌症例の糞便検体から、MiSeqシステムを用いた複数サンプル解析用のIndexが付与されたライブラリーの作製し、細菌叢解析を施行している。糞便より、いくつかのキット使用し、ボルテックス時間等の抽出条件を変えて、DNAを抽出した。DNAの収量と品質に基づき抽出条件を決定した。Preliminaryの実験により、16S rRNA領域をPCRによって増幅し、得られたサンプルを利用し、2シーケンスを施行した。
現在も、24サンプルのリクルート(術前後のため、症例数は12例以下)を目標に、可及的速やかに収集し、収集完了次第、シーケンス解析及び臨床データー解析を施行予定である。
被験者のリクルートは継続している。本年、研究協力者である長崎大学病院・病理診断科の岡野慎士教授と連携する事が決定し、今後、長崎大学病院の乳癌患者症例の臨床研究への参加登録をする予定としているため、症例の蓄積はこれまでより円滑にすすむと考えられる。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

16S Metagenomic Sequencing Library作製は、糞便よりDNAを抽出し、16S V3-V4領域(本研究)に対し、特異的プライマーを用いたPCRで増幅後、最大12 x 8 = 96サンプルの検体にインデックスアダプターを付加し、シーケンスライブラリーを作製、同時にMiSeqシステムでシーケンス配列を読み取り解析する。そのため、1ランのシーケンス時には、解析する多検体を入手しておく必要がある。現在、被験者のリクルート段階で、少なくとも24検体入手した後にシーケンスを 施行する予定である。
健常人からのパイロットスタディーとしての腸内細菌叢の解析を施行できているが、コロナ感染症拡大が思った以上に続いたため、福岡歯科大学の研究可能な乳癌症例の症例数か思うように伸びなかった。
また、MiSeqを操作する技官の体調不良のための退職と新規雇用に時間を要したため、DNAの抽出作業、シーケンスにおける、各種条件設定に時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

今後以下の研究を施行する。
A.健常人及び乳癌患者の糞便のメタゲノム解析：健常人及び乳癌患者の糞便を採取し、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析を施行し、乳癌患者に特徴的に見られる細菌群を同定する。
B.乳癌のサブタイプ解析と臨床病理学的事項の腸内細菌叢の関連性の検討：乳癌のサブタイプ、臨床病期や組織型、リンパ節転移、vなどの臨床病理学的事項とAの細菌群との相関を検討する。
C.末梢血単核球及び腫瘍内炎症細胞のサブタイプ解析と腸内細菌叢の関連性の検討：健常人及び乳癌患者より末梢血単核球あるいは腫瘍内浸潤炎症細胞を分離し、抑制性Ｔ細胞及び骨髄由来抑制性細胞、Th1、Th17細胞などを解析し、Aで同定された細菌群との相関を検討する。
D.乳癌組織の免疫微小環境のサブタイプ化と腸内細菌叢の関連性の検討：TCGAで公開されている大規模乳癌遺伝子情報と免疫関連サブタイプの遺伝子プロファイル及びホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織からのような断片化したmRNAを使用しても信頼性のあるmRNA解析を可能にするNanostring技術を利用することによって、小規模サンプルでも的確で信頼性のある免疫関連の微小環境のサブタイプ化を行う。このサブタイプとAで同定された細菌群との相関を検討する。

Causes of Carryover

16S Metagenomic Sequencingは、最大96サンプルを同時にシーケンスすることでコストを下げることができる。現在、DNA抽出に関わる条件設定は完了しており、シーケンスのデーターもワークすることがわかっているものの、なおもコロナ感染症拡大のため、症例数の確保が思うようにすすんでいない。被験者のリクルートに関して、本年、長崎大学病院と連携する事が決定している。今後、長崎大学病院の乳癌患者症例の臨床研究への参加登録により、症例の蓄積はこれまでより円滑にすすむことが見込まれる。従って、今後購入されるシーケンス試薬にかかる費用を次年度使用に繰り越し、前述の研究計画を速やかに遂行する。