2019 Fiscal Year Research-status Report

Identification of salivary citrullination-related substances using salivaomic analysis

Research Project

Project/Area Number	19K24107
Research Institution	Kanagawa Dental College
Principal Investigator	坂口和歌子神奈川歯科大学, 大学院歯学研究科, 助教 (50420972)
Project Period (FY)	2019-08-30 – 2021-03-31
Keywords	関節リウマチ / DBAマウス / シトルリン化 / プロテオミクス解析
Outline of Annual Research Achievements	研究目的：今回の研究では、関節リウマチ (RA) の発症に関与するシトルリン化タンパクを唾液から検出し、シトルリン化の同定を解明することにより、RA を早期診断へと導くことを目的としている。研究内容：2019年度は、RAのモデルマウスであるDBAマウスを用いて動物実験を中心に行った。RAの慢性モデルマウスを作成し、軽症モデルと血液・唾液・足骨中の自己抗体抗CCP抗体量をELISA法にて比較した.また、モデルマウスの、血液、唾液、足をプロテオミクス解析したところ、3者に共通したタンパクが見つかった。ウェスタンブロッティングの結果、このタンパクは、RA初期段階において、より強く発現しており、RA発症に関与していることが示唆された。抗CCP抗体は、慢性モデルのほうが、血液、唾液中も強く出現していた。また、慢性モデルとコントロールマウスの足骨をマイクロCTで撮影、病理組織像を制作して比較した。これらの結果から、今回のモデルマウスは慢性RAのマウスとして確立され、血液、唾液、足骨からRA発症に関わるタンパクが同定されたことにより、足骨で炎症が励起され、タンパクをシトルリン化、血中に運ばれ、唾液中にも自己抗体が検出されることが検証できた。このRA初期モデルからも検出されたことから、このタンパクとCCP抗体が早期に唾液中から検出されたら、RAの早期診断に導くことができると考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 予想していたタンパクがあらゆる手法で検出でき、数回再現できた。ELISAでのデータは統計解析でも立証できた。リウマチの発症に関与しているシトルリン化タンパクがどこで作られ、どのように作用しているか証明できた。
Strategy for Future Research Activity	今まで出たデータを整理し、ウェスタンブロッティングや免疫染色のデータなど、より鮮明なデータになるよう、抗体や条件を変えて再度実験を行っているところである。今年度も論文制作に向け必要に応じて追加実験を行っていき、今年度中に論文を完成させる予定である。
Causes of Carryover	前年度は動物実験を中心に行った。それに必要な薬剤や抗体、およびプロテオーム解析に使用したが、まだ免疫染色が終了していない。さらに、論文投稿の為、きれいなデータを出すため抗体を変えて追加実験が必要な状態である。今年度は、追加実験のための抗体や機材などの消耗品購入に使用する。また、この結果を可能だったら国際学会で発表し、論文作成予定である為、そのための旅費と投稿料、英文校正の費用などに使用予定である。