2019 Fiscal Year Research-status Report
Integrating Computational and Experimental Approaches for New Paradigms in Molecule Synthesis
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19KK0150
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
渡辺 賢二 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (50360938)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 道大 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (10629695)
恒松 雄太 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (30629697)
岸本 真治 静岡県立大学, 薬学部, 助教 (40814330)
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| Project Period (FY) |
2019-10-07 – 2022-03-31
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| Keywords | spiro-carbon / monooxygenase / FAD / 天然物 / 生合成酵素 / epoxidation |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【目的】スピロ環は天然物において広く見られる構造であり、生物活性において重要な役割を持つ。近年、スピロ環を含む創薬リード化合物も多く開発され、スピロ環に対する関心は高まりつつある。このことから、酵素反応によりスピロ環を高収率で産生できるようになれば、様々な医薬品の開発につながることが期待される。我々はAspergillus fumigatus 由来のスピロ環化合物であるazaspireneとspirotryprostatin Aに着目し、そのスピロ環形成機構の解明を目指した。
【方法・結果・考察】これまでの研究により、spirotryprostatin A のスピロ環は酵素FqzBが形成することが明らかになっている1）。このFqzBがスピロ環を形成するメカニズムを明らかにすべく、FqzBの結晶化を試みた。まず、fqzBを大腸菌BL21 (DE3) 株に導入し、組み換え遺伝子の発現を行った。フレンチプレスを用いて発現宿主大腸菌を破砕し、破砕液から三段階のクロマトグラフィーでFqzBを高純度に精製した後、結晶化条件のスクリーニングを行った。得られた結晶を用いたX線構造解析より、フラビン結合型のFqzBの結晶構造を解明することに成功した。FqzBの結晶構造を確認すると、フラビンの近傍にスペースを確認でき、ここに基質が入り込むことが予想された。
Azaspirene中のスピロ環形成は酵素PsoGが担う事がpsoGのノックアウト実験から示唆されていたが、基質、メカニズムともに不明であった。そこで、A. fumigatus A1159株のpsoG欠損株から基質となる化合物の探索を行った。psoG欠損株の培養液から野生株で検出されない化合物１を単離し、NMR解析によりその構造を決定した。次に、psoGを導入した酵母からミクロソーム画分を取得し、化合物１を反応させた。すると、azaspireneの生成を確認することができ、PsoGが化合物１を変換してスピロ環を形成していることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
リザーバーに終濃度が20% （v/v）になるようにエチレングリコールを加えたものにタンパク質結晶を数秒間浸して、凍結処理を行った後、液体窒素で瞬間冷凍した。凍結したFqzBの結晶をUniPuck （Crystal Positioning Systems）に充填し、液体窒素中に保管した。これに高エネルギー加速器研究機構のビームラインBL17Aを用いて、Ｘ線回折実験を行ったところ、分解能2.4A, 空間群P212121, a=55, b=68, c=122°, β=90°で回折データを得ることに成功し、結晶構造を解明できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、基質との共結晶化を行い、スピロ環形成機構の精密機能解明に取り組んでいる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの影響で学会の中止、さらには米国への渡航制限により旅費支出ができなくなったため。
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