2019 Fiscal Year Research-status Report
Fluorescent imaging probes for epigenetic enzymes with specialized amino acids
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19KK0197
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
中川 秀彦 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (80281674)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川口 充康 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 講師 (10735682)
家田 直弥 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 助教 (00642026)
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| Project Period (FY) |
2019-10-07 – 2023-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / エピジェネティクス / イメージング / ケミカルバイオロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エピジェネティック制御は近年大きな注目を集めている遺伝子発現及び細胞制御機構の１つであり、生命維持の基本的機構に関わると共に、多くの疾患に関連することが明らかになりつつある。エピジェネティック制御酵素の活性検出蛍光プローブの開発手法について検討し、各酵素特異的なイメージングプローブを開発するを目標として研究に着手した。
これまでにin vitro蛍光プローブの開発を進めてきたエピジェネティック酵素の１種であるSIRTアイソザイムについて、まず開発を進めることとした。SIRTはタンパク質リシン側鎖に生じたエピジェネティック修飾の１つであるアセチル化修飾を加水分解しアミノ基に変換する活性を有する酵素として報告されたが、アイソザイムのいくつかは脱アセチル化のみならず、脱アシル化を触媒することが近年報告された。特に長鎖脂肪酸由来のアシル基が結合したリシン側鎖の加水分解を行うことが知られ、アセチル化とアシル化の機能の違いが注目されている。そこで、本年度はアシル化修飾をイメージングできるプローブを目指し、これまで開発したプローブの改良を行なった。まず、SIRT2選択的なin vitro用プローブを設計・合成した。すでに開発したSIRT1/2/6全てに反応性を持つプローブのペプチド配列部を精査し、SIRT2に高い選択性を有する配列を選別し、SIRT2選択的in vitro用蛍光プローブの開発に成功した。当該プローブについて、ペプチド長を短縮することで細胞内への導入を試みたが、適切な反応性を維持したまま細胞内に導入できる短縮ペプチドを見出すことはできなかった。
一方、すでに開発したプローブを用いることにより、脱アセチル化よりも脱アシル化（長鎖脂肪酸アシル基）活性を阻害する阻害剤開発を行い、脱アシル化阻害活性が優位となる阻害剤候補を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はこれまで開発したプローブの改良を行ない、よりSIRT2特異性の高いプローブを取得することに成功した。すでに開発したSIRT1/2/6全てに反応性を持つプローブのペプチド配列部を精査し、SIRT2に高い選択性を有する配列を選別し、SIRT2選択的in vitro用蛍光プローブの開発に成功した。これにより、SIRT2をイメージングするための基本的な蛍光プローブが取得できたこととなる。以前に開発した特異性の低いプローブについてはペプチド長を短縮することで細胞適用可能となり、SIRT活性の細胞イメージングに成功したことから、本年度開発プローブについても細胞に適用するため、当該プローブについて、ペプチド長を短縮することで細胞内導入の効率向上を試みたが、適切な反応性を維持したまま細胞内に導入できる短縮ペプチドを見出すことはできなかった。ペプチド長と反応特異性のバランスについて精査する必要が認識されたと同時に、細胞膜透過性について異なる戦略の方が有効である可能性が示された。
一方、すでに開発したプローブを用いることにより、脱アセチル化よりも脱アシル化（長鎖脂肪酸アシル基）活性を阻害する阻害剤開発を行い、脱アシル化阻害活性が優位となる阻害剤候補を見出した。これにより、脱アシル化活性を脱アセチル化活性と区別することが可能であると実証的に示すことができ、イメージングプローブについても活性選択的プローブを開発可能であることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、引き続きSIRT2選択的プローブについて細胞内適用を可能とする改良について検討する。新たな戦略としてポリアルギニン鎖導入による細胞膜透過性検討を行う。また、異なる配列によるSIRTアイソザイム選択性の検討を行い、他のアイソザイム選択的配列を同定する。
これら選択的配列を有するペプチドについて、海外共同研究者が有する技術である非天然アミノ酸含有ペプチド発現技術を用いて、SIRTアイソザイム特異的高分子ペプチドプローブを開発する。すでに配列情報が得られているSIRT2について先行して研究を進める。高分子ペプチド型プローブについては細胞内インジェクションにより反応性・イメージング効率について検証を行い、さらにポリアルギニン化による細胞内導入を検討する。また、非天然アミノ酸タンパク質発現の技術を汎用性の高いものとするため、細胞内導入後に蛍光団、消光団の導入を行えるよう、クリック反応を活用した蛍光団、消光団、ペプチド側鎖の検討を進める。これらの検討のうち、非天然アミノ酸を用いる検討については海外共同研究者の研究室で研究代表者、研究分担者が実施する。
本研究により見出した阻害剤については、ポリアルギニン化戦略により細胞膜透過性を付与する検討を行い、イメージングプローブと併用することで、酵素活性イメージングの検証に用いる。
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| Causes of Carryover |
本年度に行った化合物合成において、分子設計した多様な化合物のうち、比較的初期に合成した化合物において、所望の基本性能を有する化合物が見出されたため、当初合成予定であった化合物の合成を省略し、酵素学的パラメータ検証など確認実験に展開することができたことから、使用金額が予定より少額となった。さらに、比較的費用を要すると見込んでいた酵素活性検出評価においても、少量の酵素試料によって検証可能なほど十分高感度な性能のプローブが開発できたため、使用金額が予定額より少なくなった。当初使用する予定であった研究費については、比較的困難が予想されるポリアルギニン鎖導入検討及び非天然アミノ酸導入の分子設計・合成・性能評価に予定額より多く充当することで、実用性の高い化合物開発を加速させる。
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Research Products
(3 results)
