2019 Fiscal Year Research-status Report
Exploration of druggable targets for metabolic bone diseases using sensitive reporter systems and integrative proteogenomic approaches
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19KK0234
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
中道 裕子 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (20350829)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801)
荒井 敦 松本歯科大学, 歯学部, 准教授 (00532772)
堀部 寛治 松本歯科大学, 歯学部, 助教 (70733509)
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| Project Period (FY) |
2019-10-07 – 2023-03-31
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| Keywords | 高感度レポーターシステム / プロテオゲノミクス / Wnt / 骨芽細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Wntシグナルの破綻は様々な病態をもたらす。これまでの疾患モデルにおけるプロテオゲノミクスによるWntシグナルの解析は、重要な発見をもたらしてきた。また、遺伝性骨疾患の研究成果より、古典的Wntシグナルが骨形成を促進することが明らかとなっている。しかしどのWntシグナル分子が骨形成に重要か不明な点が多い。海外共同研究者Michael Ben Major博士は癌細胞を用いて、質量分析中心のプロテオミクス、機能的ゲノミクスおよび疾患情報に基づく発見主体の科学を続け、Wntシグナル分子の同定に成功してきた。一方、応募者は骨代謝研究を専門とし、Wnt受容体Ror2およびRykの骨代謝における役割を解明してきた。2019年度において、Major研究室で開発した解析プラットフォームを利用して、骨形成におけるWntシグナル調節因子を同定するための実験系樹立に従事した。具体的には①ゲノムワイド遺伝子機能獲得アプローチであるCrispr-A, 遺伝子機能喪失アプローチであるCrispr-KOライブラリーの準備、および両Crisprスクリーニングに用いる二つのWntシグナル高感度レポーターシステムの構築を行った。さらに②リン酸化質量分析により、5つのBiological replicateのマウス骨髄間葉細胞株ST2において共通にシグナル強度が上昇するリン酸化ペプチドを得ることが出来た。今後行う予定の③活性化リン酸化酵素を定量するmultiplexed kinase inhibitor beads-質量分析(MIB/MS)も合わせた統合的解析により代謝性骨疾患の治療薬標的(druggable) 分子を決定する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Crispr-AシステムとWnt活性の上昇に応じて赤色蛍光色素の発光とともにゼオシン耐性を獲得するシステムBAR-RedZeoレポーターを組み合わせることで、Wntシグナル促進因子、すなわち骨形成促進因子を単離出来る。Crispr-KOシステムとBAR-RedZeoレポーターを組み合わせると骨形成抑制因子を単離出来る。BAR-RedZeoレポーター・HEK293モノクローナル細胞を作製したところ、Zeocinアナログの存在下においてWnt3aは、Zeocin アナログ誘導性の細胞死から細胞をレスキューすることが出来た。また、BAR-RedZeoレポーター・ST2細胞は、添加したWnt３aの濃度に依存した赤色蛍光を発し、Wnt処理72時間で6000倍ものシグナル強度に達した。したがって、BAR-RedZeoレポーターとCrispr-A/KOシステムによるWntシグナルの正/負の調節因子すなわち骨形成促進/抑制因子スクリーニングの準備が整った。また、Crispr-AシステムとWnt活性の上昇に応じて緑色蛍光色素の発光とともにジフテリアトキシン感受性を獲得し細胞死を誘導するシステムBAR-DTRGFPレポーターを組み合わせることで、Wntシグナル抑制因子、すなわち骨形成抑制因子を単離することが出来る。BAR-DTRGFPレポーター発現ST2モノクローナル細胞を作製したところ、ジフテリアトキシンの存在下においてWnt3aは濃度依存的に細胞死を誘導することが出来た。したがって、Crispr-A/KOシステムによるWntシグナルの負/正の調節因子すなわち骨形成抑制/促進因子スクリーニングの準備を整えることが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度においてWntシグナル活性依存的な細胞死誘導・レスキューシステムの構築に成功した。今後は、このシステムを有効活用出来る、最適なCrisp-AとKOライブラリーの精製に取り組む。ライブラリーの調製は、中道と堀部が行う。その後ライブラリーをBAR-RedZeoレポーター発現HEK293モノクローナル細胞、BAR-RedZeoレポーター発現ST2モノクローナル細胞およびBAR-DTRGFP 発現ST2モノクローナル細胞に導入してスクリーニングを中道が行う。目的遺伝子同定のための次世代シークエンス解析に用いるプライマーセットを中道が準備する。次世代シークエンス解析は、海外共同研究者のセントルイスワシントン大学のMajor教授の研究室で行う。また、活性化リン酸化酵素を定量するmultiplexed kinase inhibitor beads-質量分析(MIB/MS)をMajor教授の研究室で行い、Wntシグナルの下流で骨形成を制御するリン酸化酵素を同定する。データ解析と解釈を中道とMajor教授および宇田川教授が行う。
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Research Products
(8 results)
