2023 Fiscal Year Research-status Report
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19KK0401
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
吉見 一人 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (50709813)
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2020 – 2024
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| Keywords | CRISPR-Cas3 / オフターゲット解析 / 標的特異性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
汎用性、安全性の高い高効率なゲノム編集ツールは、様々なライフサイエンス分野の基礎研究・応用研究両面に必要不可欠な技術である。国産ゲノム編集技術として開発したCRISPR-Cas3を社会実装できるゲノム編集ツールとして確立するためには、安全性や効率などを正確に評価する必要があるが、CRISPR-Cas3の標的特異性を正確に評価できる解析手法は確立されていない。本課題研究では、スイス連邦工科大学のJacob Corn教授らと共に、CRISPR-Cas3の生体内ゲノム編集における正確な評価システムの開発を目指している。
本年度は、2020年から2021年にスイス連邦工科大学に滞在してChip-seq技術を用いて樹立した新規オフターゲット検出法DISC 3-seqの検証を行った。実際にin silico解析でオフターゲット候補領域を含む複数領域を選択して検証した結果、DISC 3-seqでもミスマッチの少ない領域の検出が可能だった一方、配列に依存しない領域も検出されたことから、CRISPR-Cas3システムが標的配列以外の領域に影響しうることが観察された。現在、DISC 3-seqのみで検出された領域についての変異導入効率を検討しており、今後細胞に加えて生体内での効果を詳細に検討することで、CRISPR-Cas3システムのゲノム編集効果を詳細に評価したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、DNA修復因子を利用したin vivoゲノム編集評価法を開発し、CRISPR-Cas3が汎用性および安全性の高いゲノム編集ツールであることを実証することである。本年度ヒト培養細胞を用いて、DNA修復関連因子Mre11に対する抗体を用いたChip-seqを行いそのピークを検出する方法をDISC 3-seqとして確立した。DISC 3-seqで検出された領域についてin silico解析で得られた領域との相関を評価した結果、少ないミスマッチ領域の検出ができる一方、配列に依存しない領域も検出されたため、これが検出エラーなのか実際の標的非特異的ゲノム編集によるものか、の検証が必要となった。そのため、2024年3-4月にスイス連邦工科大学に滞在して再度検証実験を行い、結果について議論を重ねているが、実証研究に遅れが生じている。次年度への計画延長を申請済みであり、最終的に、正確なオン・オフターゲット検出法として利用可能かを検証し、具体的な数値としてオフターゲット効果を算出する方法の確立を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
異なる標的配列、特にオフターゲットが生じる可能性が高い標的を念頭に、継続したChip-seq解析を行うとともにDISC 3-seqのみで検出された領域についての変異導入効率を検討し、全ゲノム中でのオンおよびオフターゲットへの効果を検討する。最終的には、得られた結果をin silico解析ツールに落とし込むことで、新しいオフターゲット予測プログラムを開発し、世界中のユーザーが利用可能なwebツール化を目指す。またin vivoゲノム編集時のオフターゲット評価を行うため、CRISPR-Cas3導入マウス、ラットを作製しており、現在機能解析中である。最終的にin vivoでのゲノム編集効率、オフターゲット効果を検討することで、遺伝子治療に向けて有用なツールであることを示す。
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