精子幹細胞を用いた神経疾患モデルラット作成技術の開発

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20019020
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 篠原 美都 Kyoto University, 医学研究科, 助教 (10372591)
• Keywords: 遺伝学 / 発生・分化 / 幹細胞 / 神経

Research Abstract

我々はこれまで精子幹細胞を中心とした生殖工学技術の開発を行い、2003年にマウス精子幹細胞の長期培養系(Germline stem, GS細胞)を確立し、これを用いて相同組換えにより遺伝子ノックアウトマウス作成にも成功した。本研究では、この技術のラットへの展開を図り、遺伝子トラップ法および相同組替えにより遺伝子ノックアウトラットの作成を試みた。
これまでの研究でラット精巣から樹立されたGS細胞にレンチウイルスで遺伝子導入し、異種移植によりヌードマウスの精巣で精子へと分化させることで、トランスジェニックラットを作成できることが分かった。しかしながらノックアウトなどES細胞の様に自在な遺伝子改変を行うためには、遺伝子導入された細胞を薬剤選択によりクローン化することが不可欠であるが、GS細胞では薬剤選択の効率が十分でない。ES細胞のような腫瘍性細胞と異なりGS細胞の増殖は緩やかであるため、G418などの薬剤の毒性を受けやすいことが原因であると考えられるが、特にマウスGS細胞に比較してラットGS細胞は更に増殖が遅いため改善が必要である。SDラットから樹立したGS細胞にトラップベクター(ROSAβ-geo)を導入しG418により遺伝子導入クローンの薬剤選択を行うことでクローンの樹立が可能であるが、複数挿入クローンが優性に選択されてしまう。我々は遺伝子導入法や培養条件の改善、ラット系統などについて検討することにより、single integration cloneを選択するプロトコールを確立した。さらにターゲッティングベクターにこのプロトコールを用いることによりクローンの樹立を行った。

Research Products

• [Journal Article] Transmission distortion by loss of p21 or p27 cyclin-dependent kinase inhibitors following competitive spermatogonial transplantation. (2010)
  • Author(s): Kanatsu-Shinohara M., Takashima S., Shinohara T.
  • Journal Title: Proc.Natl.Acad.Sci.USA (In press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genetic influences in mouse spermatogonial stem cell self-renewal. (2010)
  • Author(s): Kanatsu-Shinohara M., Ogonuki N., Miki H., Inoue K., Morimoto H., Takashima S.Ogura A., Shinohara T.
  • Journal Title: J.Reprod.Dev. 56(1) Pages: 145-153
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phenotypic plasticity of mouse spermatogonial stem cells. (2009)
  • Author(s): Morimoto H., Kanatsu-Shion ohara M., Takashima S., Chuma S., Nakatsuji N., Shinohara T.
  • Journal Title: PLoS One. 4(11) Pages: e7909
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Bone marrow engraftment but limited expansion of hematopoietic cells from multipotent germline stem cells derived from neonatal mouse testis. (2009)
  • Author(s): Yoshimoto M., Heike T., Chang H., Kanatsu-Shinohara M., Baba S., Varnau J.T., Shinohara T., Yoder M, C., Nakahata T.
  • Journal Title: Exp.Hematol. 37(12) Pages: 1400-1410
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genetic reconstitution of mouse spermatogonial stem cell self-renewal in vitro by Ras/cyclin D2 activation. (2009)
  • Author(s): Lee J., Kanatsu-Shinohara M., Morimoto H., Kazuki Y.Takashima S., Oshimura M., Toyokuni S., Shinohara T.
  • Journal Title: Cell Stem Cell 5(1) Pages: 76-86
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Large-scale production of growing oocytes in vitro from neonatal mouse ovaries. (2009)
  • Author(s): Honda A., Hirose M., Inoue K., Hiura H., Miki H., Ogonuki N., Sugimoto M., Abe K., Kanatsu-Shinohara M., Kono T., Shinohara T., Ogura A.
  • Journal Title: Int.J., Dev.Biol. 53(4) Pages: 605-613
  • Peer Reviewed