2008 Fiscal Year Annual Research Report
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20019038
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
筒井 秀和 Osaka University, 医学系研究科, 助教 (30392038)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡村 康司 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80201987)
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| Keywords | 細胞膜 / 蛍光蛋白質 |
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| Research Abstract |
申請者がこれまで開発してきた膜電位プローブは、通常、細胞膜に一様に発現する。今回、極性細胞などにおいて、一部のコンパートメントに局在させる各論的方法を探索することにした。まず、神経細胞において、主要な神経インパルスの発生部位であるinitial segmentに局在させることを第一目標と定めた。ここで、Initial segmentには、電位依存性ナトリウムチャネルや、KCNQ2, 3チャネルが局在することに着目した。それらは、アンキリンGという足場となる蛋白質と相互作用して局在を実現していることが知られている。KCNQ2, 3チャネル内に存在する、アンキリン結合ドメインを、膜電位プローブに癒合したコンストラクトを作成し、ラット海馬由来の初代培養神経細胞へLipofection法を用いて遺伝子導入した。2〜3日後にレーザー走査共焦点顕微鏡で観察したところ、期待に反して、アンキリン結合ドメインがない場合と同様に、細胞膜に一様な発現様式を観察した。足場であるアンキリンが摂動を受けた可能性を検討するために、細胞をパラフォルムアルデヒドで固定後、抗アンキリンG抗体で免疫組織化学を行い、その局在を調べた。アンキリンGの発現は、遺伝子導入されていない細胞と同様に、initial segmentに局在していた。このことから、膜電位プローブに導入したアンキリン結合ドメインが、正しく相互作用できていない可能性が考えられる。また、アッセイ糸での発現量が多すぎて、initial segmentに局在できる容量を超えてしまっているのかもしれない。今後はこれらの点を検討していく。
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Research Products
(3 results)
