2009 Fiscal Year Annual Research Report
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20200035
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| Research Institution | Mitsubishi Kagaku Institute of Life Sciences |
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Principal Investigator |
河野 俊之 Mitsubishi Kagaku Institute of Life Sciences, 研究部門・蛋白質立体構造研究グループ, 主任研究員 (40416657)
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| Keywords | 生物物理 / NMR / 無細胞タンパク質合成 / 安定同位体標識 |
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| Research Abstract |
我々が開発したMAGICAL法は、特殊な安定同位体標識を20通り行った蛋白試料を無細胞蛋白質合成系により調製し、それぞれの蛋白質に対して2次元HN(CO)/HN(CA)/H(N)CA/H(NCO)CA/H(N)CO/H(NCA)CO-TROSYを測定し、それらを組み合わせて解析することで従来法に必要な濃度の1/10程度の極低濃度の目的蛋白質を用いて、より高分子量で不安定な蛋白質のNMRシグナルをも簡便に帰属可能にする方法である。昨年度は、このMAGICAL法において、より高感度に測定ができるように、パルスプログラムの改良や安定同位体標識方法の改良を行い、特に測定感度が低い、H(N)CAIH(NCO)CA-TROSYやH(NCA)CO-TROSYなどの測定感度を大幅に向上させることができるようになった。本年度は、この改良MAGICAL法を、小胞体ストレスセンサー蛋白質であるIRE1p蛋白質に適用することを試みた。この蛋白質は非常に素性が悪く、最高でも30μM程度の溶解度しかなく、従来の3次元NMRを用いたシグナル帰属方法では解析が不可能であった。しかし、昨年度我々が改良したMAGICAL法を適用し、20通りの安定同位体標識を行い、2次元のHN(CO)/HN(CA)/H(N)CA/intra-H(N)CA/H(NCO)CA/H(N)CO/H(NCA)CO-TROSYスペクトルを測定し、NMRスペクトル解析を行うことでほぼすべてのHNシグナルの帰属を行うことができた。
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