2008 Fiscal Year Annual Research Report
アセチルグルコサミン糖鎖サイクルの生体制御機構の解析
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20249018
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
谷口 直之 Osaka University, 微生物病研究所, 教授 (90002188)
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| Keywords | 糖鎖 / シグナル / N-アセチルグルコサミン / 糖ヌクレオチド / 糖鎖サイクル / 糖鎖機能 / 細胞膜受容体 / オルガネラ |
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| Research Abstract |
糖鎖の生理機能は、単糖、糖ヌクレオチド、それらの輸送体、糖転移酵素のレベルと局在、糖分解酵素、細胞表面の受容体など、多くの要因によって調節されている。我々は声らの機能を統合的に理解するため糖鎖サイクルという機能的なサイクルの存在を提唱している。細胞表面の受容体上に存在する糖鎖は、極微量で且つ多様な構造を有することから、その構造解析に際し、高分離能で高感度な分析法が必要である。キャピラリー電気泳動(CE)は、質量分析計との接続が可能で、かつHPLC等に比べて試料の吸着が少ない利点を有することから、極微量糖鎖の高速・高感度分析に適した手法と考えられる本年度は、糖鎖修飾を制御する分子の一つである糖ヌクレオチドに着目し、それらの発現レベルや細胞内局在性を把握するための一斉定量法を検討した。8種類の糖ヌクレオチド及び主要な12種類のヌクレオチドの混合物を用い、分離条件を検討した結果、疎水性などが異なる特定の逆相カラムを用いたイオンペア逆相HPLCにより、全てを良好に分離することに成功した。本法はGDP-Fucなどの含量が少ない糖ヌクレオチドの定量も可能であった。細胞内糖ヌクレオチドの発現レベルは培養状態の変化に伴って顕著に変化していることも確認した。例えば、細胞密度が高まると、UDP-GlcNAcとUDP-GalNAcは約6倍に、CMP-NeuAcやGDP-Fucも約2-3倍に増加した。更に、DNAマイクロアレイにより、これらの変動に関わった糖ヌクレオチド生合成酵素遺伝子を同定した。現在は、本法を小胞体やゴルジ体などのオルガネラに局在する糖ヌクレオチドの定量に応用している。このほか、GnT-IIIの反応機構の解析、これまでinvitroや過剰発現系でしか測定できなかったGnT-IXの活性測定法の開発に成功し、脳での存在を明らかにした。またGnT-IXのKOマウスの作成にも成功している。本研究は今後の脳などの生体組織での糖鎖サイクルの意義を知る大きな手がかりとなる結果となった。
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