2010 Fiscal Year Annual Research Report
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20300167
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
小畠 英理 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 准教授 (00225484)
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| Keywords | RNA解析 / 生体機能分子プローブ / ルシフェラーゼ / ARM-ペプチド / 構造変化 |
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| Research Abstract |
本申請課題では、細胞内で発現している特定RNAを時空間的に定量解析することを目的としている。このために、特定RNA配列を認識して適切な三次構造を形成するRNAプローブ、およびRNAプローブとの結合による構造変化を介して活性のon-off制御が可能なタンパク質プローブを設計した。この2種類のプローブを細胞内に導入し、細胞内の特定部位で特定RNAの濃度に応答して起きる発光活性変化をリアルタイムに追跡できるシステムの構築を目指した。
前年度までに構築したRNA結合ペプチドとルシフェラーゼ分割断片との融合タンパク質(RLuc probe)を用いて、Rluc probeおよびオリゴRNAを細胞内で生産し、細胞内で転写されてくるmRNAのイメージングを試みた。まずRluc probeの細胞内発現用プラスミドを構築し、細胞への導入により株化細胞を樹立した。次いで株化した細胞に対して、targetとなるmRNAに合わせて設計したオリゴRNA転写用プラスミドを導入し、mRNAの転写レベルに応じた酵素活性回復が見られることを明らかにした。さらにRLuc probeの細胞内での局在と発現量を核外輸送シグナル配列付加とTet-systemを利用することにより制御できることを示した。これら局在と発現量が制御され生細胞内で安定発現したRLuc probeのRNA導入時の活性変化を評価し、RLuc probeは生細胞内でもRNAに対する特異性と活性変化を示すことを明らかにした。最後に外部から細胞内部に導入したRNAの検出に成功し、本研究で構築したRLuc probe、split-RNA probeが生細胞中でも設計通りに機能することを明示した。
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Research Products
(4 results)
