2008 Fiscal Year Annual Research Report
酵素進化工学が先導する新規モノマー導入型バイオポリマーの完全生合成システムの創成
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20310050
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田口 精一 Hokkaido University, 大学院・工学研究科, 教授 (70216828)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 敏文 北海道大学, 大学院・工学研究科, 准教授 (80291235)
松本 謙一郎 北海道大学, 大学院・工学研究科, 助教 (80360642)
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| Keywords | 生分解性プラスチック / ポリヒドロキシアルカン酸 / 進化分子工学 / 重合酵素 / 基質特異性 / モノマー組成 / 乳酸ポリマー |
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| Research Abstract |
資源循環サイクルに組み込まれるバイオプラスチック生合成酵素の進化工学的改変をとおして、バイオポリエステルの生産性・物性を積極的に改善する研究を展開している。今年度は、3HBをベースとしたPHA共重合体を合成できるpseudomonas sp.61-3重合酵素(PhaCps)を対象に、特に共重合組成(3HBとそれ以外のモノマーユニットとのモル比)と分子量の精密制御可能なpmの合進化酵素を多数創出し、それら構造機能相関解析から優良変異効果の総括的考察および、各種進化酵素の植物体での発現解析に移行した!
対象酵素PhaCpsは、3HBベースのPHA共重合体を合成できるが、3HB基質取り込み能力が微弱であるという課題があった。そこで、この性質を利用することによって、3HBだけから成るPHBホモポリマーの蓄積能力が向上する(PhaCpsの3HBに対する基質特異性向上あるいは全活性の向上)ということを指標とした点変異導入と効率的なスクリーニング系を基盤とした新酵素創成システムを築した。この確立した人工進化システムから得られた複数の優良変異部位4箇所(130,325,477,481)のうち、130番目と325番目は酵素活性そのもののに関与し、477番目と481番目は基質特異性に関与することが明らかとなった。この知見に基づき、組換え大腸菌(b酸化系変異株LS5218使用し、C4からC12までのモノマー基質を供給できる酵素遺伝子(phaAReBReJPa)を補強した状態)によって生成されるポリマーの解析から、優良変異の組み合わせから共重合体中の3HB分率が14%から93%の幅で制御できる進化酵素群を取り揃えることができた。また、477部位がGlyに置換が導入されると分子量が低下し、逆にArgに置換されると向上することがわかり、一アミノ酸置換で分子量制御も可能であった。
以上の結果は、側鎖のサイズを系統的に変えたCoA体脂肪酸モノマーを化学合成し、インビトロでの活性試験をした結果とよく符合し、生成ポリマーの解析結果とよい相関を示すことがわかった。この進化酵素をベースに乳酸んモノマーユニットの取り込み実験をしたところ、大変幸運なことにポリマー鎖内への取り込みを確認できた。すなわち、初めて微生物細胞内で乳酸モノマーを含むバイオポリマーの合成に成功したことになる。ポリマーの解析結果から、P(6%乳酸-co-94%3HB)の新規2元共重合体となっていた。
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