2009 Fiscal Year Annual Research Report
酵素進化工学が先導する新規モノマー導入型バイオポリマーの完全生合成システムの創成
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20310050
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田口 精一 Hokkaido University, 大学院・工学研究科, 教授 (70216828)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 敏文 北海道大学, 大学院・工学研究科, 准教授 (80291235)
松本 謙一郎 北海道大学, 大学院・工学研究科, 助教 (80360642)
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| Keywords | 生分解性プラスチック / 乳酸ポリマー / 進化分子工学 / モノマー組成 / 基質特異性 / 重合酵素 |
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| Research Abstract |
環境調和型バイオプラスチック生合成酵素の進化工学的改変を実施することで、バイオポリエステルの生産性・物性を積極的に改善する研究を展開している。今年度は、3HBをベースとしたPHA共重合体を合成できるPseudomonas sp.61-3重合酵素(PhaC_<ps>)を対象に、特に共重合組成(乳酸ユニットとそれ以外のモノマーユニットとのモル比)と分子量の精密制御可能なPHAの合成進化酵素を多数創出し、それら構造機能相関解析から優良変異効果の総括的考察および、各種進化酵素の植物体での発現解析に移行した。
対象酵素PhaC_<ps>は、乳酸ベースのPHA共重合体を合成できるが、コポリマー中の乳酸基質取り込み能力が6%と微弱であった。そこで、人工進化システムから得られた複数の優良変異部位4箇所(130,325,477,481)のうち、130番目と325番目は酵素活性そのもののに関与し、477番目と481番目は基質特異性に関与することが明らかとなった。この知見に基づき、組換え大腸菌(b酸化系変異株LS5218使用し、C4からC12までのモノマー基質を供給できる酵素遺伝子(phaA_<Rc>B_<Re>J_<Pa>)を補強した状態)によって生成されるポリマーの解析から、優良変異の組み合わせから共重合体中の3HB分率が14%から93%の幅で制御できる進化酵素群を取り揃えることができた。本結果は、側鎖のサイズを系統的に変えたCoA体脂肪酸モノマーを化学合成し、インビトロでの活性試験をした結果とよく符合し、生成ポリマーの解析結果とよい相関を示すことがわかった。この進化酵素をベースに乳酸モノマーユニットの取り込み実験をした結果、高分率で乳酸ユニットのポリマー鎖内への取り込みを確認できた。
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