2010 Fiscal Year Annual Research Report
酵素進化工学が先導する新規モノマー導入型バイオポリマーの完全生合成システムの創成
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20310050
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田口 精一 北海道大学, 大学院・工学研究院, 教授 (70216828)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 敏文 北海道大学, 大学院・工学研究院, 准教授 (80291235)
松本 謙一郎 北海道大学, 大学院・工学研究院, 助教 (80360642)
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| Keywords | 生分解性プラスチック / ポリヒドロキシアルカン酸 / 重合酵素 / キラルモノマー / 基質特異性 / 乳酸ポリマー / 進化分子工学 / ポリマー物性 |
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| Research Abstract |
低炭素社会の構築を目指した研究として、環境調和型バイオプラスチックの生合成酵素の進化工学的改変を実施し、微生物ポリマーのの生産性・物性を積極的に改善する研究を展開してきた。最終年度は、乳酸モノマーベースとした共重合体を合成できるPseudomonas sp.61-3重合酵素を対象に、特に乳酸ユニットと共重合化する他種モノマーとの組成およびポリマー分子量の精密制御可能なPHAの合成進化酵素を系統的人工進化により多数創出できた。取得した変異体ライブラリーの機能マッピングにより、酵素活性の増強や基質特異性に関与する優良変異効果の総括的考察および、重合過程における乳酸モノマーユニットのポリマー鎖への取り込み反応の解析へと展開した。
本乳酸重合酵素は、乳酸ベースのPHA共重合体を合成できるが、コポリマー中の乳酸基質取り込み能力が数%と微弱であった。すでに、人工進化実験により特定された複数の優良変異部位4箇所のうち、130番目と325番目は酵素活性そのもののに関与し、477番目と481番目は基質特異性に関与することが明らかとなった。この知見に基づき、組換え大腸菌(β酸化系変異株を使用し、C4からC12までのモノマー基質を供給できる酵素遺伝子(phaA_<Re>B_<Re>J_<Pa>)を補強した状態)によって生成されるポリマーの解析から、優良変異の組み合わせから共重合体中の3HB分率が広域幅(数%から70数%)で制御できる進化酵素群を取り揃えることができた。本結果は、側鎖のサイズを系統的に変えたCoA体脂肪酸モノマーを化学合成し、インビトロでの活性試験をした結果とよく符合した。最後に、合成ポリマーの熱的・機械的物性を丁寧に調べた。その結果、乳酸分率の上昇に伴い、ガラス転移温度が向上し、透明性も増した。また、硬質製のポリ乳酸よりも柔軟性を取り込み、従来にないポリマー特性を発現することが新たに明らかとなった。
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