2010 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノムコピー数多型がもたらす表現型の解析を可能にする人工染色体ベクター操作技術
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20310120
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
井上 敏昭 鳥取大学, 医学部, 准教授 (80305573)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 基伸 鳥取大学, 医学部, 助教 (00273904)
大林 徹也 鳥取大学, 生命機能研究支援センター, 准教授 (80348804)
難波 英二 鳥取大学, 生命機能研究支援センター, 教授 (40237631)
武谷 浩之 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (60222105)
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| Keywords | ゲノムコピー数多型 / 人工染色体ベクター |
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| Research Abstract |
BAC由来の外来遺伝子ゲノムを多数搭載することのできる可能なMultiple Gateway人工染色体ベクターが出発資材であり、この作出が最重要課題である。人工染色体ベクター構築は相同組み換えを利用する染色体改変技術を基にしており、このためには高頻度で相同組み換えが起こるニワトリDT40細胞株を染色体改変の「場」とする。我々が人工染色体作製の出発材料としているのはヒト21番染色体であり、これを保持するDT40細胞はすでに取得している。昨年度は選択マーカー再構成系を利用したlamda phage組み替え系を構築したが、動物細胞内での組み替え効率は期待よりも低いことが分かった。そこで今年度は組み替えシステムについて動物細胞内での組み替え効率高いことが分かっているPhic31組み替え系を活用したものの構築を進めた。まずは外来遺伝子搭載部位配列(attB)を多数配したプラスミドを構築し、これをCre-Lox P系でCHO細胞内に保持された人工染色体ベクター上に搭載することに成功した。この人工染色体ベクター(attB-HAC)はCHO細胞内で安定に保持されていた。
attB-HACに対し、外来遺伝子としてNeoカセットを用いて導入効率を検討したところ、PhiC31組み換え酵素依存的に50%以上の高効率でattBサイトに導入できていることが確認できた。一回のトランスフェクションで何コピーの外来遺伝子の導入ができるかどうかをサザンブロットで解析したところ、attB上に外来遺伝子が搭載されたクローンでは、多くのクローンで複数コピー(3コピー以上)搭載されていると考えられた。
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Research Products
(14 results)
